Вид Campylobacter

План:

1. Аннотация, введение………………………..………………………………….2

2. Методы…………………………………………………………………….……4

2.1Шштаммы бактерий и  условия роста…………………...…………...…….…4

2.2.Анализы формирования  биопленки………………………...……….…….....4

2.3 Счет бактерий……………………………………..……………………...…...5

2.4 Микроскопия………………………………………………………..……...….6

2.5 определение последовательности  аминокислотных остатков 16С рДНК………………………………………………………………………...…......7

3. Результаты…………………………………………………………………..…..7

3.1 Наблюдения качества  формирования биопленок Campylobacter……...…..7

3.2 Количественные наблюдения  формирования Campylobacter биопленки…8

3.3 Прямое наблюдение за  формированием биопленки методом  сканирующей электронной микроскопией……….……………………………10

4. Исследование…………………………………………………………….……11

5. Благодарности………………………………………………………………....13

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Возможность (потенциал) формирования биопленки  разновидностью бактерий  рода, вида Campylobacter

(Нереус В. Гюнтер IV, Чин-Уайи Чен)

 

1. Аннотация

Способности формирования биопленки 16 штаммами, которые являются представителями 14 из 16 разновидностей содержащих вид  Campylobacter, были обнаружены на стекле, нержавеющей стали и полистироле. Формирование биопленки считается средством, благодаря которому Campylobacter выживает в неблагоприятной среде. Из восьми микроаэрофильных разновидностей Campylobacter, включая два штамма Campylobacter jejuni и Campylobacter fetus, только штамм C.jejuni 81- 176 точно может производить видимую биопленку на разных поверхностях. Все шесть штаммов разновидности анаэробных Campylobacter точно производят видимую биопленку на разные поверхности. Электронные микрофотографии отдельных биопленок показали относительно однородную биопленку, произведенную анаэробными штаммами, в то время как, микроаэрофильный C.jejuni штамм 81-176 производит биопленку содержащую одинаковое количество спиральных и коккоидных форм. Это исследование указывает на различие в потенциале (возможности) формирования биопленки и морфологии бактерий содержащихся в биопленке между анаэробной и микроаэрофильной разновидности Campylobacter. Кроме того, различия, обнаруженные в способности формирования биопленки двух C.jejuni штаммов, указывают необходимость дальнейших исследований возможностей формирования биопленки этих разновидностей, используя большее количество штаммов.

Опубликовано Элсивер  ЛТД(на русский переводится как  ООО)

 

2.Введение

Вид Campylobacter состоит из шестнадцати разновидностей, некоторые из которых содержат различные подвиды (Мандрелл и др., 2005;Он, 1995). Все разновидности Campylobacter чрезвычайно привередливые бактерии, которые с большей вероятностью растут в богатой лабораторной среде (условиях) (Парк, 2002). Оптимальная температура роста этих организмов в пределах 35- 42 ˚С (Инглис и Калищук, 2003). Разновидности Campylobacter могут подразделяться на две группы: микроаэрофильным разновидностям нужна атмосфера со сниженным уровнем содержания кислорода (3- 15%) и эти разновидности предпочитают только анаэробную среду (Он, 1996). Строгие требования роста разновидностей Campylobacter бросают вызов появлению хорошей культуры из клинических образцов, а также поддержанию и хорошему росту в лабораторных условиях. Все современные разновидности Campylobacter задействованы, по меньшей мере, в одном патологическом процессе у людей и/или домашних животных и поэтому считаются патогеннами (Эбботт и др., 2005; Горкевич и др., 2002; Ихара и др., 2003; Лабарка и др., 2002; Он, 1996; Мачуч и Таннер, 2000; Невел, 2005; Сигуэра и Рокас, 2003; Содерстром и др., 1991; Тэм и др., 2003; Ти и др., 1998; Верно и др., 2002). Разновидности Campylobacter являются основными возбудителями пищевых желудочно- кишечных бактериальных инфекций в развитом мире, по оценкам вызывая в 12,7 случаях на 100.000 человек в одних Соединенных Штатах (Парк, 2002;  Филдс и Шелрдлоу, 1999; СДС, 2006). Как полагают Campylobacter jejuni и Campylobacter coli составляют большую часть человеческих заболеваний связанных с Campylobacter инфекциями (Тэм и др., 2003; Мур и др., 2005). Как бы то ни было, из- за раннее упомянутых затруднений в культурировании разновидностей Campylobacter, из клинических образцов, в настоящее время трудно узнать о влиянии разновидностей Campylobacter на заболевания людей и домашних животных.

Способность Campylobacter выживать без продуктов питания и являться причиной такого большого числа человеческих заболеваний, несмотря на их привередливую природу и чувствительность к уровню кислорода в окружающей среде, очень загадочное явление. В настоящее время методы благодаря которым Campylobacter  борется (преодолевает) негативные влияния окружающей среды не известны. Недавно, некоторые ученные исследовали способность C.jejuni формировать клейкие бактериальные сообщества, известные как биопленки (Дайкес и др., 2003;Трачу и Франк, 2002 и др.). Бактерии, включая Campylobacter, формирующиеся в биопленку, демонстрируют превосходную сопротивляемость окружающим и фармакологическим атакам, позволяющие выжить в смертельной среде. Штаммы C.jejuni формируют биопленку на нержавеющей стали, хлористом поливиниле, нитроцеллюлозных мембранах, волокняных  стеклянных фильтрах и стекле (Камокоф и др., 2006). Это говорит о возможном механизме сохранения C.jejuni в неблагоприятных условиях. Как бы то ни было, изучение способности формирования биопленки не jejuni  разновидности Campylobacter не завершены. В представленной работе мы анализируем 16 образцов штаммов 14-ти из 16 разновидностей Campylobacter, чтобы определить могут ли они формировать биопленку на ряд соответствующих поверхностей при одинаковых условиях роста.

 

2. Методы

2.1Шштаммы бактерий  и условия роста.

Шестнадцать различных штаммов  Campylobacter используемых в этом изучении и их основные инкубационные условия перечислены в таб. 1. Штаммы были культурированны из замороженных запасов (- 80˚С) непосредственно Brusella (Бектон Дикинсон, Спаркс, МД) пластины агара? ( 1.5% агарозы). Все штаммы Campylobacter были выращены в среде Brucella (среда для выращивания микроорганизмов). Пластины и среда для выращивания были статически инкубированы при 42º С (эта температура не идеальна для всех микроаэрофильных видов, но постоянно поддерживалась для удобства сравнения) для микроаэрофильных штаммов и 37˚С для анаэробных штаммов.

 

2.2.Анализы формирования  биопленки

Развитие бипленки на стекле, нержавеющей стали и полистироле  было визуализировано и посчитано  в среде Brucella, статически инкубированной, в раннее упомянутых атмосферных условиях и температуре. Количественная оценка биопленки была выполнена с использованием ранее описанного анализа (Проути и др., 2002; Соломон и др., 2005) : петля для посева (дословный перевод) всех замороженных запасов были высеяны на Brucella агар (микроаэрофильные) или Brucella агар дополненный 0,3% формиатом и фумаратом (анаэробные) и инкубированные в раннее описанных условиях 48 часов. Была использована одна колония для инокуляции 10 мл в Bruccela среду (микроаэрофильн.) или Bruccela среда с добавлением 0,3% формиата и фумарата (анаэробные) в 50-ти мл коническую трубу(я так понимаю, имеется ввиду пробирка), и инкубирована в выше описанных условиях 48 часов. Пять микролитров этой жидкой культуры были использованы в 50-ти мл конической трубке, содержащей 20 мл Bruccela среды или Bruccela среду с формиатом и фумиратом и разовый купон (я думаю, имеется ввиду полоска материала) желаемой поверхности для тестирования на формирования биопленки. Дополнительно в каждый эксперимент был включен негативный контроль, который состоит из полоски интересующего материала в 20 мл Bruccela среде без инокуляции каких- либо бактерий. Перед использованием в качестве поверхностей для формирования биопленок все плоски (купоны) были тщательно подготовлены. Предметные стекла микроскопа (7.5 см*2.5 см, Эско. № 2954 простые слайды микроскопа (стекла) , Эри Сайнтифик, Портмоус, НГ) были первоначально очищены, используя моющее средство (Алконокс, Инк. Уайт Плайнс, Нью-Йорк), и промыты в деонизированной воде (ddH2O), перед пропитыванием в ацетоне. Затем они были высушены на воздухе и завернуты в фольгу и обработаны в автоклаве перед использованием. Пластины из нержавеющей стали (7.5 см* 2.5 см) были вырезаны из листов нержавеющей стали 304 №4 и отделаны (RA 23-32 ) с обеих сторон. Пластины (купоны) из н. стали были очищены и стерилизованы также как и стеклянные пластины. Пластины из полистирола (2.4 см* 2.4 см) были отрезаны с одноразовой чашки Петри (Фишер САйнтифик, Уалтам, МА) «в доме», используя промышленный лазер. Пластиковые купоны были почищены жидким моющим средством и промыты ddH2O. Пластины стерилизованы ультрафиолетовым светом в течение 30 минут и хранилось в стерилизованной алюминиевой фольге. Затем колбы были инкубированы статически в соответствующих условиях для микроаэрофильных штаммов 48 часов, а для анаэробных штаммов 72 часа. После инкубации питательная среда выливалась и поверхность купона (пластины) были изучены (наблюдались) невооруженным глазом на наличие биопленки. Затем все купоны (пластины) разогревались в течение 30 минут при 80˚ С, чтобы закрепить биопленку к поверхности купона и уменьшить вероятность того, что механическое воздействие окрашивания и промывки может сместить биопленку с тестовой поверхности. Затем купоны (пластины) были погружены в 25 мл 0,1 % кристаллическую фиолетовую краску по меньшей мере на пять минут, затем промыты струёй 25 мл фосфатно- буферном растворе 25-ти мл пипеткой. Краска (красящее вещество) сохранившаяся в биопленке, прикрепившаяся к поверхности купона была солюбилизирована в 25-ти мл 95 % этанола. Три аликвоты 200 мл были взяты из каждого солюбилизированного образца и каждый аликвот был помещен в отдельную пластину. Абсорбция при 590 нм (не знаю что это) трех образцов из культуры биопленки была затем прочтена при помощи микропланшетного считывателя и результаты были осреднены (Сафмр, Тесан, Рисерч Траянгл Парк, НС). Из данных собравших анализы изменения (расхождения, несоответствий, различий) при помощи «Смешанной» процедуры системы обеспечения САС было определено влияние взаимодействие видов и поверхности ( САС Инститьют Инк., 2004). Средние разделения были выполнены при помощи техники Бонферрори ЛСД (Миллер, 2001). Анализы были проведены раздельно для микроаэрофильных видов и анаэробных видов.

 

2.3 Счет бактерий

Рост каждого из видов  Campylobacter был измерен, используя туже среду и те же условия роста, какие были использованы при исследованиях роста биопленки. Единственным различием в условиях роста в обоих экспериментах было отсутствие, какого- либо купона в культуре. Образцы были изъяты из растущих культур на 30 или 48 часов и был использован метод 6*6 для подсчета культур бактерий; с 18 репликантами на разведение (Чен и др., 2003).

 

2.4 Микроскопия

Морфология различных  видов Campylobacter растущих в биопленках была изучена, используя и обычную световую микроскопию, и сканирующую электронную микроскопию. Биопленки для микроскопии были культурированы, используя те же условия, что и при исследовании биопленки. Как бы то ни было, в данном случае полоски покрытые стеклом (2.2 см* 2.2 см, Эри Сайнтифик, Портсмоус, НХ) были использованы как поверхность для формирования биопленки. Как только биопленки окультурировали покрытие, полоски были изъяты из среды роста и немедленно помещены в 2.5 % глутаральдегид в 0.1м имидазол буфера (рН 7.0) (Электрон Микроскопии Сайнс), по меньшей мере, на 2 часа при комнатной температуре. Затем образцы были обезвожены в серии растворов этанола ( 50%, 80%, 100%). Образцы были высушены до критической точки жидкой двуокисью углерода и покрыты тонким слоем золота. Затем, был использован электронный сканирующий микроскоп в высоком вакууме в дополнительном режиме визуализации для наблюдения за биопленкой в 250x, 2500x и 10,000x увеличении. Образцы биопленок каждого вида получили цифровое отображение для включения в эту работу.

 

2.5 определение  последовательности аминокислотных  остатков 16С рДНК

Ген 16С рДНК усиливался от хромосомной ДНК, полученных из каждой из 16-ти штаммов Campylobacter ( изначально выбран основой для надежности их видообразования) были использованы в изучении. Праймеры EubA (AAGGAGGTGATCCANCCRCA) и EubB (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) были использованы усиления зоны 1540- bp гена 16S rRNA. Праймеры EubA, EubB и два дополнительных праймера 519F (CAGCMGCCGCGGTAAAWC) и 519R (GWATTACCGCGGCKGCTG)  были использованы для полной последовательности, раннее усиленного, 1540bp PCR фрагмента. В результате последовательности были сравнены с набором последовательностей GenBank, используя Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (если переводить дословно Основной Инструмент Местного Поиска) для того, чтобы определить идентичность видов Campylobacter штаммов.

 

 

3. Результаты

3.1 Наблюдения  качества формирования биопленок  Campylobacter

Первоначально, наличие или  отсутствие биопленки было отмечено вместе с видом и местонахождением биопленки на купоне, и количество дубликатов, на которых была представлена биопленка. Данные полученные из этих качественных наблюдений (наблюдений качества)  представлены в таблице 2. Все видимые биопленки были образованы на границе жидкости и  воздуха на поверхности купона. Первоначально, эксперименты были выполнены, используя  стеклянные купоны (талоны, листы), как  поверхность для формирования биопленки. Было произведено три отдельных  биопленки на экспериментах со стеклом, используя микроаэрофильных  штаммов  Campylobacter, где каждый штамм был выращен в трех экземплярах труб (имеют ввиду колбы)  для каждого эксперимента. Штамм 81-176 произвел видимую бипленку на стекло в каждом из трех отдельных экспериментов и на каждый из трех отдельных купонов, использованных в эксперименте. Ни один из других штаммов разновидности микроаэрофильных Campylobacter не произвел видимой биопленки на какой- либо из стеклянных купонов в экспериментах. В отличие от микроаэрофильных видов, образцы штаммов разновидности анаэробных Campylobacter образовали биопленку на стекле в каждом из трех экспериментов.

Затем были исследованы возможности  видов Campylobacter формировать биопленку на продуктах питания , использовалась качественная нержавеющая сталь. И снова, штамм 81-176 C.jejuni произвел биопленку, но на этот раз только на трех из шести купонов из нержавеющей стали, использованных в эксперименте. Как бы то ни было, в отличие от стеклянной поверхности, некоторые из других видов микроаэрофильных Campylobacter были способны сформировать биопленку едва заметную невооруженным глазом. Все эти штаммы формировали биопленку спорадически, растущей на одной поверхности, но не на другой, как было в случае с C.jejuni RM1221, Campylobacter sputorum, Campylobacter upsaliensis, Campylobacter hyointestinalis и Campylobacter helveticus. Также результаты анаэробных штаммов на нержавеющей стали отличаются от тех, что наблюдали раньше на стекле. Campylobacter concisus сформировал биопленку на шести купонах, в то время как Campylobacter curvus, Campylobacter gracilis, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis, Campylobacter rectus сформировали биопленку, но меньшей степени консестенции на поверхности нержавеющей стали (Табличка 2).

И наконец, была протестирована возможность видов Campylobacter формировать биопленку на полистирол. Все штаммы микроаэрофильного Campylobacter вида, включая C.jejuni 81- 176, не смогли сформировать видимую биопленку на пластиковой поверхности. Совсем по- другому вели себя анаэробные Campylobacter виды, наблюдения показали, что они легко формировали видимую биопленку на поверхности, по меньшей мере, на одном из шести пластиковых купонах, используемых в экспериментах (Табл. 2).

 

3.2 Количественные  наблюдения формирования Campylobacter биопленки

Определение количества биопленки, произведенной микроаэрофильными  штаммами на стекле, представлены на табл. 1А. Табл. 1А содержит наблюдения за качеством из табл.2, показывающей, что штамм C.jejuni 81- 176 формирует значительно большее количество материала биопленки, по сравнению с отрицательным контролем и остальными испытаниями микроаэрофильными видами Campylobacter.

Исследования биопленки  микроаэрофильных штаммов выращенных на нержавеющей стали (Табл.1В) предоставили одно наблюдение соответствующее предыдущим наблюдениям качества, 81- 176 штаммы продемонстрировали гораздо более значительную плотность биопленки (р<0.05) по сравнению с негативным контролем и также большинство других микроаэрофильных штаммов не произвели видимые биопленки. Как бы то ни было, C.sputorum и C.hyointestinalis, которые произвели видимую биопленку на одинаковое количество купонов из нержавеющей стали не произвели (среднюю) величину значительно отличающуюся от негативного контроля. К тому же, три других микроаэрофильных штаммов (C/jejuni RM1221, C.upssalientis, C.helveticus), которые продемонстрировали совершенно не плотное формирование биопленки, не произвели результатов, значительно отличающихся от негативного контроля или от других штаммов, которые произвели видимую биопленку.