Методы исследования биологических мембран

 

 

Для прогресса гистологии, цитологии и эмбриологии большое  значение имеет внедрение достижений физики и химии, новых методов  смежных наук — биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии.

Современные методы исследования позволяют изучать ткани не только как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для  изучения их жизнедеятельности в  течение длительного времени, выделять отдельные клеточные органеллы  и составляющие их макромолекулы (например, ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Такие возможности открылись  в связи с созданием новых  приборов и технологий — различных  типов микроскопов, компьютерной техники, рентгеноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого  с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получения гибридов; использования  биотехнологических методов — получения  гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.

Основными методами изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной  и клинической практике.

Микроскопирование — основной метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. С момента  создания и применения первых микроскопов  они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные  оптические системы, обладающие высокой  разрешающей способностью. Размер самой  маленькой структуры, которую можно  видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d_o), которое в основном зависит от длины волны света (λ) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой d_o = 1/2λ Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы.

                                     Электронная микроскопия.

      Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии были создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 1, Б). В электронном микроскопе используется поток электронов с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. При напряжении 50000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т.е. в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1—0,7 нм.

В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного  представления о структурах применяют  СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный  микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает»  остро сфокусированным электронным  пучком отдельные точки поверхности. Для исследования выбранного участка  микрозонд двигается по его поверхности  под действием отклоняющих катушек (принцип телевизионной развертки). Такое исследование объекта называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, —  растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами  растровой электронной микроскопии  являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения  увеличения (от десятков до десятков тысяч  раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия  по методу замораживания — скалывания применяется для изучения деталей  строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (—160°С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через  середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок  мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью  ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют  в вакууме микроскопа при -160°С.

Метод электронной микроскопии  «замораживание — травление» применяют  для изучения внешней поверхности  мембран клеток. После быстрого замораживания  клеток при очень низкой температуре  блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем  возгонки воды в вакууме. Затем участки  клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания  — скалывания и замораживания  — травления позволяют изучать  нефиксированные клетки без образования  в них артефактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют  исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин). При  негативном контрастировании изучают  агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые  нити).

Электронная микроскопия  ультратонких срезов, полученных методом  криоулътра-микротомии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и  заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при  температуре —196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов  клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут  на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения  активности ферментов, а также для  проведения иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют  антитела, связанные с частицами  коллоидного золота, локализацию  которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной  микроскопии. Используют электронные  микроскопы с ускоряющим напряжением  до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов  в том, что они позволяют исследовать  объекты большой толщины (1—10 мкм), так как при высокой энергии  электронов они меньше поглощаются  объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о  трехмерной организации внутриклеточных  структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Требования к  препарату:

Должен быть тонким, так  как электроны быстро поглощаются  и рассеивают вещество. С другой  стороны  исследуемые объекты  должны  быть устойчивы к электронной  бомбардировке.

В электронном  микроскопе  носителями являются электроны. Источник  электронов- подогреваемый  катод-1. 2-электронная пушка- это система  из фокусированного электрода и анода, которые  ускоряют электроны, и  образуют пучок. АВ- предмет  с  которым взаимодействует поток  электронов. Затем поток электронов  преобразуется  и содержит информацию о предмете. Формирование  потока  электронов  происходит под  воздействием электрополя (это система электронов и конденсаторов).

Электронные линзы:

3- конденсаторная

4-электронная

5-проекционная

Изображение регистрируется на чувствительной фотопластинке.

 

                              Электронный парамагнитный резонанс.

         ЭПР — это очень ценный метод изучения мембран. Обычно в качестве меток используются стабильные парамагнитные соединения, содержащие нитроксидный радикал. Неспаренный электрон при наложении сильного магнитного поля переходит с одного энергетического уровня на другой под действием микроволнового излучения. Метод очень чувствителен: обычно спектр регистрируется при концентрации спиновых меток около 10"*М в 50 мкл образца. Спектр ЭПР, как правило, представляют в виде первой производной от спектра поглощения.

В спектре  нитроксидного радикала имеются  три пика, отвечающие спин-спиновым взаимодействиям неспаренного электрона  и ядра атома азота. И положение  спектра, и расщепление, обусловленное  спином ядра, зависят от ориентации молекулы относительно внешнего поля. Как мы уже говорили в предыдущем разделе, это означает, что характер спектра зависит от характера  вращения молекулы. На рис. 5.3 приведены  спектры для самых разных случаев  — от свободного вращения до полной неподвижности. Для того чтобы найти  т_к в предположении, что вращательное движение молекулы изотропно, можно использовать простое уравнение, в которое входит высота пиков. Этот подход наиболее применим для такой метки, как TEMPO.

Спиновые  метки — производные жирных кислот или фосфолипидов, — конечно, не вращаются изотропно, и в этом случае для нахождения параметра  упорядоченности S из величины расщепления между линиями спектра используется вторая простая формула. Предположив, что такие метки имеют форму жесткого стержня, можно из величины параметра S оценить максимальное отклонение зонда от нормали к поверхности мембраны.

Многие  предположения, которые делаются при  нахождении из спектров ЭПР времен вращательной корреляции или параметра  S, снижают ценность этого метода для определения количественных характеристик молекул. Эти параметры тем не менее позволяют получить качественное представление о поведении мембраны. Результаты измерения степени упорядоченности спиновых меток, фиксированных в мембране на разной глубине, свидетельствуют об увеличении неупорядоченности в направлении от поверхности мембраны к ее центральной области. Качественно такая же картина получена с помощью ²Н-ЯМР. Во многих исследованиях проводилось сравнение текучести мембран, которую определяли по данным о величинах т_к и S для спиновых меток, при различных возмущающих воздействиях.

                     Дифференциальная сканирующая калориметрия.

В биологических мембранах  липидный слой по всем имеющимся данным представляет собой жидкое тело с  вязкостью, близкой к вязкости подсолнечного  масла. Строго говоря текучесть мембраны ограничена внутренней гидрофобной  фазой, которая состоит из углеводородных цепей жирных кислот. Эта фаза, однако, не всегда бывает жидкой. При охлаждении до температур ниже 10^оС мембраны замерзают, т.е. жидкая фаза затвердевает, приобретая свойства двумерного кристалла.

В мембранах, образованныых  синтетическими липидами, фазовый переход  из жидкого в твёрдое состояние  может происходить при более  высоких температурах, в зависимости от химического состава фосфолипида. В таблице 1 приведены температуры фазовых переходов некоторых синтетических фосфатидилхолинов (лецитинов).

Таблица 1. Температуры плавления некоторых синтетических фосфолипидов

Жирные кислоты	Название остатка жирной кислоты	Сокращённое название фосффолипида	Температура плавления,  Tc, oC
14:0	Миристоил	ДМЛ	23
16:0	Пальмитоил	ДПЛ	41
18:0	Стеароил	ДСЛ	58
18:1	Олеил	ДОЛ	-21(цис-форма)

Полное название фосфолипидов: ДМЛ - 1,2-димиристоилфосфатидилхолин (ещё одно возможное сокращение - ДМФХ) и так далее.

Для изучения фазовых переходов  при нагревании используют метод  дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (сокращённо - ДСК). Не останавливаясь на конструкции прибора, отметим только, что в конечном счёте с его  помощью записывается кривая теплоёмкости, т.е. зависимость теплоёмкости липидов  или мембран в суспензии от температуры

Рисунок 1. Фазовые переходы в суспензии фосфолипидных везикул (липосом) по данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК)

Перед приготовлением липосом  к фосфолипидам было дабавлено разное количество холестерина; его содержание в молярных процентах указано  у кривых.

По оси ординат отложена теплоёмкость, по оси абсцисс - температура, K.

Метод называется дифференциальным, потому что измеряется только теплоёмкость суспендированного материала на фоне гораздо большей теплоёмкости раствора сравнения. Примеры таких  кривых даны на рис.1, где приведены  кривые ДСК для дистеароилфосфатидилхолина (ДСЛ). На этих кривых, в частности, видно  увеличение температурного интервала  фазового перехода при добавлении к  липиду в мембране холестерина.

Параметры кривых теплоемкости

На рисунке 2 слева более  подробно обозначены параметры кривой ДСК. На первом этапе нас будут  интерессовать три из них:

1 - Температура фазового  перехода ("плавления") T_c.

2 - Температурный интервал ("ширина") фазового перехода.

3 - Общее количество тепла  Q, поглощённого при плавлении. Оно представляет собой площадь под кривой ДСК, т.е. функции C=f(T)

С - теплоёмкость. T - полуширина фазового перехода, Tc - температура плавления. Заштрихованная область соответствует  количеству тепла, поглощённого при  нагревании до температуры T.

Рисунок 2. Характеристик фазовых переходов в липидах по данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

Кривые плавления

Кривой плавления называется зависимость доли жидкой фазы в общем  количестве изучаемого вещества, в  данном случае - липидов мембран.                   

 

a - доля жидкой фазы,  T - температура, Tc - температура плавления ( = 0,5), ml - количество липида в жидкой фазе, ms -количество липида в твёрдой фазе.

Рисунок 3. Кривая плавления липидов в липосомах, приготовленных из ДПЛ