Клітинна селекція ярого ріпаку в умовах in vitro на стійкість проти посухи

Необхідно відмітити, що оцінити внесок клітинної селекції в процес сомаклональної мінливості досить важко. Для цього бажано методично  чітко відокремлювати дві складові єдиного процесу формоутворення - сомаклональну варіабельність і селективний відбір.

Спадкова передача ознак  від батьківських клітин своїм нащадкам - процес консервативний, але ця консервативність не є абсолютною. У деяких випадках мають місце помилки, в результаті чого структура хромосом або послідовність нуклеотидів ДНК дочірних клітин стає іншою. Ці раптові, зміни спадкового матеріалу називають мутаціями. Клітини або організми, які є носіями змінених генів і відрізняються від вихідного (дикого) типу, називають мутантами. Мутації можуть стосуватись як ядерних генів, так і їх цитоплазматичних структур, що несуть у собі ДНК (мітохондрії, хлоропласти) [11].

 Розрізняють такі  типи мутацій:

1. Генні, або точкові,  мутації - спадкові зміни гена, які можна, ідентифікувати методами гібридологічного аналізу за характером ознак, що фенотипово виявляються у нащадків. Генні мутації частіше відбуваються в одному з двох алельних локусів пари гомологічних хромосом. По відношенню до алельних генів дикого типу мутантні гени є переважно рецесивними. Іноді вони виявляються домінантними. Гомозиготний стан рецесивних мутацій частіше буває летальним, іноді - нейтральним і дуже рідко може позитивно відбиватися на життєдіяльності особин.

Це положення справедливе  не тільки для генних, але й для всіх інших типів мутацій.

2. Хромосомні мутації  - одна або декілька хромосом  виявляють структурні зміни. Характеризуються  змінами у морфологічних структурах  хромосом, викликаними розривами  та перебудовами хромосомного матеріалу.

3. Геномні мутації обумовлені змінами числа хромосом в хромосомних наборах (геномах) або ж змінами кількості хромосомних наборів у мутованих клітинах. Геномні мутації, як правило, викликають явище поліплоїдії.

4. Плазмонні мутації виникають  внаслідок можливих, мутацій позахромосомних спадкових структур клітини, окрім локалізованих у пластидах.

5. Пластидні мутації характеризуються  змінами пластид, хлорофільних  зерен. Викликані мутаціями спадкових  факторів (генів), які локалізовані  у пластидах. Відрізнити плазмонні  мутації від пластидних методами гібридологічного аналізу неможливо. У цих випадках аналізують обумовлений пластидними мутаціями характер успадкування білоплямистості, строкатолистості у зелених рослин, Крім того, використовують тонкі методи біохімічного аналізу ДНК хлоропластів, білків тілакоїдних мембран та ін [11].

Мутація будь-якого гена може завершитися  повною або частковою втратою  його функціональної активності. Наслідком  цього може бути припинення синтезу  важливого для метаболізму білка, що обумовить летальний ефект. Якщо ж мутація вихідної структури гена тільки видозмінює білок, то це може прискорювати, або гальмувати, або змінювати метаболічні реакції, що неминуче позначиться у фенотовій ознаці.

Мутагенез - процес виникнення мутацій  під впливом різних фізичних і хімічних мутагенних факторів. Достатня фізіологічна гомогенність культури клітин і малий розмір клітинних агрегатів дозволяють мутагенам і селективним факторам ефективно впливати відразу на велику кількість клітин [6].

Серед хімічних супермутагенів in vitro використовують два класи речовин: клас НАК (нітрозоалкілсечовин) і ДАК (діазокетонів). Найбільш поширені супермутагени: етилметансульфонат (ЕМС); диметилсульфонах (ДМС); метилметансульфонат (ММС); етиленімін (ЕІ); N-нітрозометилсечовина (НМС), та ін. Розчини мутагенів готують, як правило, на середовищі для культивування і додають до суспензії клітин. Через певний час клітини промивають середовищем від мутагенів і ресуспензують у свіжому середовищі [21].

Причиною геномних мутацій  може бути і калусогенез. Відомо, що при заживанні фізичних травм у рослин утворюються калусні клітини, які в нормі не виявляються. Це означає, що у відповідь на травмування генотип реагує синтезом додаткових білків, ферментів або метаболітів, необхідних для репараційних процесів, Калусну тканину можна одержати відносно легко також in vitro. Якщо з калусної тканини виникають ембріоїди або пагони, то частина з них буває поліплоїдною, що свідчить про здійснення генних мутацій. На цьому принципі грунтується метод декапітації, який використовують для подвоєння хромосом [7].

Поряд з хімічними  мутагенами в експериментах з  культурами клітин широко використовують іонізуюче (рентгенівське, гамма-промені) і ультрафіолетове випромінювання. Найбільш широкий спектр мутацій  спостерігається при використанні іонізуючого випромінювання. При рентгенівському опроміненні клітин, вченими одержані пігмент-дефектні лінії дурману і петунії, хлоратстійкі лінії тютюну. Х- та γ-опромінення гаплоїдних протопластів сприяє виділенню ауксотрофних мутантів. Ауксотрофи - клітини, які втрачають здатність синтезувати одну речовину (з-поміж групи простих речовин), необхідну для їх росту [30]. Фенотип ауксотрофів у рослин позначають латинськими літерами, які символізують сполуку, необхідну для їх життєдіяльності. Наприклад, символами Ле^-, Меt, Тhi^- позначають ауксотрофи, які потребують ізолейцин, метіонін і тіамін, відповідно [1]. Для одержання мутантів в умовах in vitro пе обов'язково діяти на клітини мутагенами. Іноді відбувається спонтанний мутагенез, який пояснюють помилками в роботі ферментів матричного синтезу ДНК. У вищих рослин існує феномен наявності мобільних (мігруючих) генетичних елементів, які спричиняють спонтанні мутації ("стрибаючі гени"). Частота виникнення різних спонтанних мутацій може коливатись в межах 10^-5-10^-8. Природними чинниками спонтанного мутаційного процесу можуть бути також гени-мутатори, біохімічна активність яких збільшує частоту мутацій інших генів у декілька десятків разів (існують, крім того, гени-антимутатори, що діють у протилежному напрямку).

Поява окремих фенотипових  змін може бути вища, якщо відбувається мутація більш ніж одного гена. Одержанню спонтанних мутацій віддається перевага для сільськогосподарських  культур (коли небажані побічні мутації) [6].

Важливою перевагою  суспензійних культур клітин є можливість застосування в роботі стандартних мікробіологічних методів. Спонтанну та індуковану частоту виникнення мутацій визначають як відношення числа мутантних клонів до діяльності виживших клонів. Для оцінки ефективності мутагенезу часто використовують значення корисної частоти мутацій, яку випначають відношенням мутантних клонів до загальної кількості висіяних клітин [15].

При вивченні мутагенезу фенотиповими маркерами можуть бути такі показники: стійкість до токсичних  концентрацій амінокислот та їх аналогів; стійкість до антибіотиків, патотоксмнів, пуринових і піримідинових основ нуклеїнових кислот, а також хлорофілдефектність. Загальна методологія відбору мутантів in vitro складається з таких етапів;

1. Селекція необхідних  фенотипових варіантів на клітинному рівні.

2. Регенерація з клітин  рослин.

3. Експресія мутаційних  змін на рівні цілих рослин-регенерантів. При цьому необхідно довести  генетичну природу мінливості  та ретельно її визначити шляхом  гібридологічного аналізу.

Селекція мутантних клітин більш ефективна, якщо після обробки мутагеном проходить певний період. Селективний тиск (перенесення мутантів на селективні поживні середовища або в екстремальні температурні умови) застосовують на різних стадіях культивування клітин після мутагенезу - від 2-х годин до тижня. Вибір часу для проведення селекції залежить від кількості клітин у вихідних колоніях, типу мутацій, стадії клітинного циклу, числа поділів мутантних клітин до початку селекції.

Способи відбору необхідних фенотипових варіантів на клітинному рівні можна класифікувати так;

- пряма (позитивна)  селекція, при якій виживає лише  певний мутантний тип клітин;

- непряма (негативна)  селекція. Грунтується на вибірковій  загибелі клітин дикого типу  та виживанні метаболічно неактивних  клітин, які потребують додаткової ідентифікації у них мутаційних змін;

- візуальна селекція  та неселективний відбір, коли  ідентифікація лінії серед всієї  популяції клітин відбувається  візуально або за допомогою  біохімічних методів ( ізоферменти,  поліморфізм білків, вторинні метаболіти та ін.);

- тотальна селекція, яка  передбачає індивідуальне тестування  всіх клітинних клонів.

Пряма селекція - найбільш поширений метод виділення мутантів стійкості до посухи, до антибіотиків, гербіцидів, токсинів та інших антиметаболітів.

1.3. Мікроклональне  розмноження ярого ріпаку

Ярий ріпак відноситься  до економічно важливих сільськогосподарських  культур. Методи його селекції постійно потребують розробок та вдосконалення  нових ефективних способів розмноження  на різних стадіях онтогенезу з метою створення нових високопродуктивних форм рослин.

У селекційному процесі  ярого ріпаку з’являються значні ускладнення, що пов`язані з розмноженням та збереженням цінного, генетично ідентичного матеріалу [2].

Розробка методу мікроклонального розмноження ярого ріпаку являє собою великий інтерес для генетико-селекційних робіт з цією сільськогосподарською культурою. Роботи по культивуванню різноманітних ізольованих тканин та органів ярого ріпаку показали їх високу морфогенну активність [21].

В порівнянні з традиційними методами  що використовуються в сільськогосподарській практиці, мікроклональне розмноження в культурі in vitro має значні переваги.

• Підвищений коефіцієнт розмноження, з однієї бруньки за місяць можна отримати до 1000 рослин регенерантів;
• Депонування рослин-регенерантів при понижених позитивних температурах (+4^оС) дає змогу довгий час зберігати її, та при потребі включати в селекційний процес;
• Метод мікроклонального розмноження економічний – невелика лабораторна площа на якій можуть бути розташовані тисячі рослин, а також скорочення строків розмноження та незалежність від пори року;
• Метод культури тканин дозволяє вести відбір генотипів, стійких до несприятливих умов середовища, бактеріозів, вірусних захворювань, то що;

Весь процес мікроклонального розмноження складається з чотирьох етапів:

1. Введення меристем в стерильну культуру. Цей етап включає в себе стерилізацію посадкового матеріалу для отримання культури вільної від мікроінфекції, та експлантація на поживне середовище.
2. Саме мікроклональне розмноження. Індукція брунькоутворення та пасаж бруньок на нове поживне середовище для збільшення їх кількості.
3. Укорінення отриманих пагонів. Досягається пересадкою ізольованих пагонів на середовище, що викликає розвиток кореневої системи (ризогенез);
4. Перенесення стерильної культури в грунт. Етап проводиться поступово, потребує деякого часу для адаптації рослин регенерантів до нестерильних умов [9].

При створенні  нових форм рослин методами біотехнології  вагоме значення має ефективність регенерації з різних експлантів. Розробці таких систем регенерації та вивченню її залежності від різних факторів (генотип, вік та вид тканини експланту, склад культурального середовища та ін.) присвячено багато досліджень [27, 28, 36, 17]. У статтях, які описують регенерацію в ріпака, використовують різні типи експлантів, такі як сегменти листків, стебел та гіпокотилів, корінці, сім'ядолі, а також різні комбінації фітогормонів у поживних середовищах [27, 35, 17].

Проте конкретні  генотипи не завжди здатні до регенерації за протоколами, описаними для даної культури. У низці робіт показано, що використання меристемних тканин дає вищу частоту регенерації, ніж застосування в ролі експланту матеріалу з високодиференційованих тканин [22, 26, 32]. Морфогенез вичленених сім'ядольних листків на штучному середовищі значною мірою залежить від розміру ізолятів. Літературні дані свідчать, що чим більший вік проростка, тим менша його здатність до морфогенезу на поживному середовищі [18]. Існують також відомості про те, що довжина експланту сприяє морфогенезу останнього [8, 37].

Для отримання  маточних рослин ярого ріпака як експлант використовували сім'ядолі листків, ізольовані із 2-3-денних проростків із довжиною черешка 2 мм. Поживне середовище для пагоноутворення з ізольованих сім'ядолей містило речовину групи цитокінінів — БАП — у концентрації 0,5 мг/л, яка індукує розвиток пазушних бруньок в культурі та стимулює ріст органів, що перебувають у стані спокою. Рослини, вирощені із сім'ядолей ріпака, через 3-4 тижні після закладання досліду живцювали й використовували для подальших досліджень мікроживці довжиною 1-2 см з однією парою вкорочених листків, які мали пазушні меристемні тканини.

При вивченні регенерації озимого ріпака як експлант можна використовувати гіпокотилі та сім'ядолі, які виділяють з проростків, вирощених на безгормональному поживному середовищі. Використання молодих тканин дає більш високу частоту регенерації завдяки тому, що вони містять різні гормональні сполуки, які сприяють морфогенезу. Регенерація пагонів у ярого ріпака може відбуватись двома шляхами:

1. Експлант при посадці в поживне середовище з 2-3 мг/л БАП та 0,1-0,9 мг/л НОК збільшувався за розмірами, а на 5-7 добу починала утворюватись недиференційована щільна калюсна тканина з великою кількістю меристематичних зон; надалі в калюсній тканині формувалась брунька, з якої розвивався пагін, а потім біля його основи утворювались придаткові корені. Це виглядало наступним чином: у морфогенному калюсі виникали листковидні та стеблевидні структури, частина яких розвивалась у нормальні пагони, а інша припиняла рости. Іноді з кал юсу одразу виникав добре сформований пагін із швидким темпом росту.
2. При поміщенні експлантів у середовище, яке містило 3-4 мг/л БАП, спостерігали утворення соматичних ембріоідів без стадії калюсоутворення на сім'ядолях та гіпокотилях, а також пагонів шляхом прямого органогенезу. Ембріоїди розвивались у пагони без утворення кореневої системи. Пагони розміром 20-30 мм, які утворилися при регенерації, поміщали в середовище, доповнене БАП із концентрацією 2-3 мг/л, що призводило до активного утворення додаткових пагонів. Відділяючи окремі пагони або групи по 2-3 штуки і пересаджуючи їх на середовище того самого складу, можна за короткий термін одержати велику кількість нових пагонів (30-40 за 9-11 тижнів). Пагони, які знову утворились, є вегетативним потомством одного експланту і зберігають генетичну ідентичність.