Клітинна селекція ярого ріпаку в умовах in vitro на стійкість проти посухи

Всі компоненти поживного  середовища, які необхідні для нормального розвитку експлантів можуть бути поділені на шість груп:

1. Основні неорганічні поживні речовини (макроелементи);
2. Мікроелементи;
3. Джерело заліза;
4. Джерело вуглецю;
5. Неорганічні добавки (регулятори росту рослин).

Середовище розроблене Мурасіге і Скугом [34] – це найбільш розповсюджене поживне середовище, що використовується як основа при роботі з культурою тканин ріпаку.

Всі середовища мають  спільний спосіб приготування – спочатку готують маточні розчини макро- та мікроелементів. Для зручності в роботі макроелементи готують у вигляді маточних розчинів з концентрацією в десять разів більшою, ніж необхідно для культури. Розчини мікроелементів готують з концентрацією в 100 разів більшою за необхідну. Всі компоненти середовища готуються на бідистильованій воді.

Маточні розчини гормональних речовин готують відповідно їх властивостям розчинятися та в концентраціях  зручних для роботи. 2,4-дихлорфеноксиоцтоову кислоту, індолілоцтову, індолілмасляну, та нафтилоцтову кислоти готують таким чином: розчиняють 100 мг речовини в 0,5 2,0 мл етанолу, підігрівають, додають бідистильовану воду до 100 мл. 100 мг бензиламінопурину розчиняють в 2 мл 0,5н НСІ, підігрівають, та доводять бідистильованою водою до100 мл. Гіберелову кислоту розчиняють у воді. Розчини таких сполук як гідролізат козеїну, дріжджовий екстракт готують безпосередньо перед дослідом [13].

Необхідно чітко дотримуватися  порядку додавання кожного інгредієнта  при приготуванні поживних середовищ. Гормональні речовини та вітаміни треба додавати останніми [21].

Мірну колбу, з третиною необхідного об`єму бідистильованої  води, поміщають на магнітну мішалку  та підігрівають, потім додають за прописом складові поживного середовища: водні розчини макро- та мікроелементів, вуглеводів вітамінів, регуляторів росту, екстрактів. Потім додають агар-агар. Середовище доводять до необхідного об`єму бідистильованою водою, рН доводять до необхідного значення додаючи 1М КОН, середовище стерилізують автоклавуванням.

В дослідженнях по добору посухостійких клітинних ліній мутантів ярого ріпаку нами використовувалося модифіковане поживне середовище Мурасіге та Скуга (склад якого представлений в табл.3) доповнене регуляторами росту (1 мг/л БАП 0,5 мг/л НОК та 0,1 мг/лІОК) як селективний агент використовували  поліетиленгліколь (ПЕГ- 6000), який є непроникною осматично активною речовиною [24].

Селективне  поживне  середовище  яке  містить ПЕГ  готується наступним чином: до калусогенного  поживного середовища одразу після  приготування додають необхідну  кількість поліетиленгліколю.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблиця 6. Склад поживного осередовища.

Компоненти	Кількість в мг/л
Макросолі
NH4NO3	1650
KNO3	1900
CaCl2•2H2O	440
MgSO4•7H2O	370
KH2PO4	170
Мікросолі
H3BO3	6,2
MnSO4•4H2O	22,3
CuSO4•5H2O	0,025
ZnSO4•7H2O	8,6
Na2MoO4•2H2O	0,25
KI	0,83
CoCl2•6H2O	0,025
FeSO4•7H2O	28
Na2EDTO•2H2O	37,3
Вітаміни
B1	0,1
B6	0,5
PP	0,5
Сахароза	30000
Агар	0,8%

 

2.5. Отримання калусу із різних експлантів

З вирощених в стерильних умовах рослин беруть цілі проростки, черешки або листові пластинки (14-18 денні рослини). Листові пластинки розрізають на сегменти 3-5 мм, роблять додаткові надрізи для кращого утворення калусу. Пагони розрізають на сегменти по 2-4 мм. Виділені експланти висаджують на стерильні поживні середовища для калусогенезу, які стерилізували автоклавуванням при 1 атм 20 хвилин [9].

Експланти листків ярого  ріпаку на модифікованому середовищі Мурасіге-Скуга (варіант І з додаванням 0,5 мг/л БАП, варіант ІІ з додаванням 1 мг/л БАП 0,5 мг/л НОК та 0,1 мг/л  ІОК) через декілька тижнів культивування в темноті проліферували калусну тканину.

Найбільш інтенсивно рихлий, здатний до регенерації калус  утворювався при субкультивуванні експлантів або цілих пагонів  на середовищі варіант ІІ.

На даному середовищі  більша  частина експлантів за 3-5 тижнів утворює калуси в кількості, достатньому для пересадки. Стерильним ланцетом зрізають знову утворений калус з вихідного експланта. Потрібно звернути увагу на розміри шматочків калусу, який переносять на свіже поживне середовище: якщо вони дуже малі, може бути пригнічений подальший ріст калусу. Отримані лінії калусних культур потребують регулярної пересадки, приблизно через кожні 4 тижні.

Культивують калусні  тканини в темнових культуральних  кімнатах або термостатах при 25±1°С, відносній вологості 70-75%.

В подальшому одержану калусну  тканину використовували для  одержання посухостійких клітинних  ліній, попередньо опромінивши їх γ-променями в дозі 20Гр [23].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблиця 7. Склад середовищ для культивування калусної тканини ярого ріпаку

Компоненти	для одержання рихлого  калусу
	І-варіант	ІІ-варіант
МС-макро	100	50
МС-мікро	1	1
Fе-хелат	5	5
м-Інозит, мг	100	100
Сахароза, г	30	30
В1	0,1	0,5
В6	0,5	_
РР	0,5	-
Гліцин, мг	2	-
Гідролізат казеїна	-	0,5
Дріжджовий екстракт	-	10
БАП	0,5	1
НОК	-	0,5
ІОК	-	0,1
Агар	0,7%	0,7%

 

2.7. Відбір посухостійких калусних ліній ярого ріпаку

Створення вихідного  селекційного матеріалу, стійкого до стресових  факторів навколишнього середовища можливе при використанні методів  клітинної селекції.

В умовах in vitro на селективних середовищах можна отримати клітини з мутантними генотипами, а потім отримувати з них рослини стійкі до селективного фактора.

Існує кілька способів відбору  резистентних клітинних ліній:

• жорстка селекція з використанням сублетальних доз стресового фактору та багаторазовим пасажуванням в селективних умовах;
• м`яка селекція на адаптивних концентраціях селективного агента протягом кількох пасажів;
• ступінчата селекція з поступовим збільшенням концентрації стресового фактора і чергуванням селективних та не селективних умов

Для одержання резистентних клітинних ліній ярого ріпаку (сорт Мірас, сорт Ліго) з листкових експлантів одержують рихлосруктурний калус, а з нього суспензійну культуру. Після 2-3 пасажів, коли суспензія стабілізується її висаджують на агаризоване поживне середовище.

Для отримання резистентних клонів як правило використовують висів  суспензії на середовище що містить  селективний фактор. Проте у ярого  ріпаку при  клонуванні суспензії, яка  гарно росте утворюються лише поодинокі колонії. Тому в роботі використовувався метод пересадки мікрокалусів, що в минулому показав гарний результат.

Для підвищення генетичної варіабельності клітинних популяцій  використовується індукований мутагенез. В якості мутагенного фактора використовувають γ-опромінення в дозі 40Гр [30].

Оброблені γ-опроміненням мікрокалуси висаджують на середовище з сублетальною концентрацією ПЕГ 6000. Для встановлення сублетальної концентрації ПЕГ 6000 суспензійну культуру висаджують на поживні середовища з різною концентрацією ПЕГ(10%; 20%; 30%; 40%) і виявляють концентрацію при якій також спостерігається значне зменшення приросту калусної тканини. Далі проводиться жорстка селекція з використанням сублетальної концентрації за схемою:

• 1,2,3 пасажі – на середовищі з селективним фактором
• 4,5 пасажі – контроль без селективного агента
• 6,7 пасажі – на селективному середовищі

В кінці першого пасажу виділяють лише світлі ділянки тканин та переносять на свіже середовище з селективним фактором. Колонії що ростуть перевіряють в селективних та неселективних умовах згідно схеми клітинної селекція [25].

В результаті послідовних  доборів виділяють резистентні  клони, що стабільно зберігають ознаку стійкості. Таким чином, застосування індукованого мутагенезу значно збільшує спектр генетичої різноманітності та дозволяє відібрати найбільш стійкі до стресів варіанти, стійкість яких найймовірніше є наслідком мутаційного процесу.

2.7. Одержання посухостійких рослин-регенерантів ярого ріпаку

Однією із важливих і  складних проблем сучасної біотехнології є регенерація цілої рослини із ізольованої клітини, яка має властивість тотипотентності (реалізація нормального морфогенезу). В її основі лежать процеси морфогенезу, показники якого визначаються темпом і орієнтацією клітинних ділень, блокуванням клітинного циклу, ростом клітин і їх диференціацією. Процеси морфогенезу індукуються змінами в експресії генів і закріпленням цієї епігенетичної мінливості клонуванням перепрограмованої ініціальної клітини. Цінність клітинних технологій, в першу чергу, визначається можливістю відновлення цілої рослини. Регенерація пагонів, коренів і інших органів в культурі in vitro є необхідною і важливою умовою успішного проведення різноманітних клітинних експериментів. Новоутворення рослин в калусних культурах що культивуються в значному ступені визначається генотипом і фізіологічним станом експлантата .

Аналіз численних даних  про вплив екзогенних регуляторів  росту та складу поживних середовищ  на індукцію калусу у ріпаку і регенераційну  здатність, показав що вони дуже розрізнені, в деяких випадках навіть суперечливі, і не піддаються відтворенню. Це пояснюється складністю культивування ріпаку в умовах in vitro і генотиповою залежністю процесу індукції морфогенних калусів.

Для індукції соматичного  ембріогенезу в калусній тканині ріпаку змінювали концентрацію екзогенних гормонів в поживному середовищі. Калуси висаджували на поживне середовище МС, доповнене 6 – бензиламінопурином в концентрації 0,05 мг/л. Пробірки переносили в світлову культуральну кімнату з заданими умовами: температура 25°С, 16-годинний фотоперіод, освітлення 3000 – 4000 лк.

Потрібно відмітити, що регенераційна здатність калусу залежала від віку калусу, вихідного  генотипу, середовища і умов культивування. З віком регенераційна здатність  калусу знижувалася. Причиною цього можуть бути цитогенетичні і фізіологічні зміни в  клітинах що культивуютться, які призводять до порушення внутріклітинного метаболізму, числа хромосом, хромосомними абераціями

Для регенерації ріпаку суттєвим є навіть такий факт, як селекційний напрямок сортів.

Рослини, вирощені із первинного або субкультивованого калусу ріпаку через 3-4 тижні, черенкували і для  подальших досліджень використовували  мікрочеренки довжиною 1 – 2 см з вкороченими  листками, які мають пазушні меристеми.