Клітинна селекція ярого ріпаку в умовах in vitro на стійкість проти посухи

Для подальшого розвитку пагони переносили на безгормональне поживне середовище. Через 2-3 тижні культивування велика кількість регенерантів досягає висоти 6-7 см, має до 5-7 листків і кореневу систему та може бути висаджена в ґрунт.

За необхідності рослини, які були одержані безпосередньо  з експлантів, а також отримані при розмноженні in vitro, можна поміщати на депонування при знижених температурах, що призводить до гальмування росту й дозволяє зберегти рослини впродовж тривалого часу без пересаджування.

Важливим етапом в  отриманні меристемних рослин, готових  для висадки в грунт, є процес укорінення проростків, що розвиваються з ізоляту. Утворення коренів можна досягнути різними шляхами: розводячи мінеральний склад солей в два рази та видаляючи регулятори росту; додаючи в поживне середовище активоване вугілля або обгортаючи нижню частину пробірки фольгою, щоб запобігти доступ світла; поміщаючи проросток у нестерильні умови грунту; додаючи в поживне середовище ауксини та цитокініни [29]

Для вкорінення відбирали пагони одного розміру з добре розвиненими листками й висаджували в поживне середовище. Одні автори [33, 31] рекомендують використовувати для вкорінення розбавлене мінеральне середовище без регуляторів росту, інші [18] радять додавати ауксини та цитокініни [29]. Укорінені рослини-регенеранти висаджують в умови відкритого ґрунту.

Заключним етапом мікроклонального розмноження є переведення рослин-регенерантів в грунт. Попереднє закалювання  та акліматизація сприяє кращому  приживанню. Пробірочні рослини ярого ріпаку висаджують в посуд з перлітом, базальтовим волокном чи ґрунтом та витримують в кліматичній камері при освітленні 5-6 кЛк та відносній вологості 90%. Краще приживання спостерігається на перліті (92-99%) та на ґрунті (90 - 94%). Через 3-4 тижні рослини можна висаджати в поле. Морфологічних відхилень листового апарату та генетичних змін не помічалося [9].

 

 

 

 

 

 

 

2. Експериментальна частина

2.1.Вихідний матеріал та методика досліджень

Робота проводиться  в лабораторії біотехнології  кафедри екобіотехнології та біорізноманіття.

Метою роботи було одержання  рослин – регенерантів ярого ріпаку стійких до посухи з використанням індукованого мутагенезу.

Обєктом досліджень були сорти ярого ріпаку Мірас та Ліго.

В наших дослідженнях ми використовувємо наступні схеми селекції:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Схема №1:

Пророщування  насіння в розчині сахарози
	↓
введення в  культуру in vitro проростків
	↓
рослина–регенерант
		↓
калус
		↓
опромінення калусу γ-опроміненням
		↓
культивування калусу на поживному середовищі з ПЕГ (1 – 3 пасаж)
		↓
культивування одержаного калусу на неселективному поживному середовищі (4, 5 пасажі)
		↓
культивування клітинних ліній на селективному поживному середовищі (6 - 8 пасаж)
		↓
відбір стійких клітинних ліній
		↓
морфогенез
		↓
регенерація стійких  рослин–регенерантів
		↓
укорінення  стійких рослин–регенерантів
		↓
адаптація та висадження в грунт
		↓
перевірка рослин – регенерантів на посухостійкість

Схема №2:

Рослина–регенерант
	↓
Калус
	↓
опромінення калусу γ-опроміненням
	↓
культивування калусу на поживному середовищі з  ПЕГ (1 – 3 пасаж)
	↓
культивування одержаного калусу на неселективному поживному середовищі (4, 5 пасажі)
	↓
культивування клітинних ліній на селективному поживному середовищі (6 - 8 пасаж)
	↓
відбір стійких клітинних ліній
	↓
Морфогенез
	↓
регенерація стійких  рослин–регенерантів
	↓
укорінення  стійких рослин–регенерантів
	↓
адаптація та висадження в грунт
	↓
перевірка рослин–регенерантів на посухостійкість

 

 

 

2.2. Вивчення стійкості проростків ріпаку до посухи та введення їх в культуру in vitro

Посуха, погіршуючи умови  живлення рослин, приводить до уповільнення розвитку ріпаку, зменшуючи довжину і міцність, внаслідок чого значно знижується продуктивність рослин. Тому важливого значення надають увагу сортам, що володіють підвищеною стійкістю до екстремальних умов середовища. У зв'язку з цим, нами проводилося вивчення сортів ріпаку з метою виділення генетичних джерел високої стрес-стійкості для використання їх в селекції та рослинництві.

Дослідження стійкості рослин ріпаку до посухи проводилося по такому фізіологічному параметру як стрес-депресія проростання  насіння в розчині сахарози, імітуючого недостачу вологи. Чим вище відсоток проростання насіння в умовах посухи, тим більше посухостійкий зразок.

Оцінка реакцій різних сортів ріпаку на стресову дію виявила  відмінності в характері зміни  фізіологічних показників. Залежно  від генотипу, сорти розрізнялися амплітудою такого фізіологічного параметру, як проростання що дозволило розділити їх на стійкі та середньостійкі.

 

Таблиця 1. Показники схожості насіння ярого ріпаку.

Сорт	Загальна кількість  насіння	Схожість насіння, шт.
Мірас	100	50
Ліго	100	70

 

Із представлених даних  можна зробити висновок, що сорт Ліго проявив себе, я к стійкий до посухи, а сорт Мірас, як середньо стійкий.

Одержані проростки  використовували для подальших  досліджень.

Стерилізували проростки  розчином „Білизни” (1:3) протягом 15 хв. Потім простерилізовані проростки тричі по 10 хв промивали в стерильній дистильованій воді. Результати стерилізації представлені в табл. 2.

Таблиця 2. Одержання асептичних проростків сортів ярого ріпаку

Сорт	Концентрація  розчину „Білизни”	Тривалість стерилізації (хв.)	Загальна кількість проростків	Кількість інфікованих  проростків через 7 діб		Ефективність  стерилізації (%)
				штук	%
Мірас	1:3	15	50	5	10	90
Ліго	1:3	15	70	10	20	80

Стерильні проростки  висаджували на поживне середовище склад якого представлений в  табл. 3.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблиця 3. Склад поживного середовища для культивування проростків ярого ріпаку

Компоненти	Кількість
Макро МС	100 мл
Мікро МС	1 мл
Вітамін МС	1 мл
Фолієва кислота	0,5 мл
Fe-хелат	5 мл
Мезоінозит	100 мг
Гідролізат казеїну	1 г
Аденін	40 мг
Гліцин	2 мг
Беатин	1 мг
ІЮК	0,1 г
Глюкоза	10 г
Сахароза	2,4 г
Агар-агар	7 г
рН 5,8

Культивували проростки  при t^о +25-26^оС, фотоперіод 14-16 годин.

2.3. Отримання асептичних рослин ярого ріпаку із насіння

Насіння ярого ріпаку ретельно миють  в теплій мильній воді, потім відмивають в проточній воді, ополіскують дистильованою водою. Далі матеріал переносять в ламінар-бокс, де проводять стерилізацію. Насіння переносять в стерильний стакан, заливають 70 % етиловим спиртом, витримують 30 секунд. Зливають спирт і заливають стерилізуючий розчин. Як стерилізатор використовували розчин „Білизни” (1:1 який містить активний хлор) та концентровану сірчану кислоту, яка крім стерилізації дає ефект швидкого проростання насіння [13]. В стерилізуючому розчині „Білизни” насіння витримували 20 хвилин, після чого розчин зливали, а в концентрованій сірчаній кислоті насіння витримували протягом 5 хвилин. Простерилізоване насіння промивали тричі по 10 хв. у стерильній дистильованій воді, відмите від стерилізуючого розчину насіння поміщали на стерильний листок фільтрувального паперу для обсихання. Стерильним пінцетом насіння переносили на безгормональне поживне середовище у пробірки для пророщування склад якого наведено у табл.1.

Пробірки з насінням культивують у термостаті без  освітлення з температурою 25±1°С. Після проростання насіння пробірки переносять у термостат з освітленням 400 лк і температурою 25±1°С. Через тиждень слід перевірити пробірки з насінням на зараженість мікроорганізмами.

Таблиця 4. Склад безгормонального поживного середовища для пророщування насіння.

Компоненти	Кількість
Макро МС	50мл
Мікро МС	0,5мл
Fe – хелат	5мл
Вітаміни по МС	1мл
Сахароза	20г
Агар	0,7%
рН середовища	5,6 – 5,8

 

Заражені пробірки слід негайно видалити з термостата, через  те що вони є джерелом інфекції. Після проростання насіння (приблизно 2 – 3тижні), відбирають пробірки з пророслим насіння і переносять їх у термостат з освітленням (400Лк) та температурою 25±1^оС.

Результати дослідів по одержанню асептичних проростків ярого ріпаку наведені в табл.5. Одержані асептичні рослини використовували в подальших дослідженнях.

Найкращім стерилізатором виявився розчин „Білизни”1:1, при якому  кількість інфікованого насіння  була для сорту Мірас– 16%, а для сорту Ліго – 26%.

Таблиця 5. Одержання асептичних проростків ярого ріпаку	Ефективність стерилізації		84	80	74	70
	Схожість насіння	%	78	64	66	42
		штук	39	32	33	21
	Кількість інфікованого насіння	%	16	20	26	30
		штук	8	10	13	15
	Загальна кількість  насіння		50	50	50	50
	Тривалість стерилізації в хв.		10	5	10	5
	Стерилізуючий розчин		"Білизна" 1:1	кH2SO4	"Білизна" 1:1	кH2SO4
	Cорти		Мірас		Ліго

 

2.4. Підбір поживного середовища для культивування ярого ріпаку

Головною умовою успішного  одержання калусу, його культивування, регенерації рослин із різних експлантів є правильний підбір концентрації та співвідношення компонентів поживного середовища.

Для кожної культури характерний  свій специфічний склад поживного  середовища, що впливає на розвиток та темпи росту вихідного матеріалу.