Aspergillus terreus — продуцент ітаконової кислоти

      Морфолого-культуральні ознаки. Колонії коричневих або помаранчево-коричневих відтінків. Вони ростуть досить швидко, обмежені чи широко розкриті, 3,5-5см в діам., плоскі або з помітними дрібними радіальними борозенками, низькі, оксамитові, іноді пухнасті, клочковатие, зазвичай з тонким краєм, з численними конідіальними головками , що додають колонії характерний вигляд, коричнево-темно-жовті, глинисто-коричневі, горіхові    Рис.3. Морфологічні особливості    або деревно-коричневі, рідше помаранчево-  г-верхня частина конідієносця         коричневих  відтінків, що наближаються до

д-конідії                            брудно-помаранчевим (рис.2). Конідіальні головки колонковидні, дуже щільні, компактні, однакової товщини по всій довжині, досить варіабельні, 150-500 х 30-50 мкм. Конідиеносці більш або менш звивисті,безбарвні, 100-250 х 4,5-6 мкм, з гладкими оболонками; апікальні розширення  полушаровидне або куполоподібні, 10-16 мкм в діаметрі. Стерігми двоярусні : базальні - щільні, паралельні, 5-7 х 2-2,5 мкм; другого ярусу - тісно скупчені, по 2-3 на кожній з базальних стерігм, 5,5-7,5 х 1,5-2 мкм . Конідії кулясті або слабоеліптичні, звичайно 1,8-2,4 мкм в діаметрі., з гладкими оболонками.( рис.3) Запах дуже слабкий або відсутній.

       Виділено з грунтів, повітря,  рослинних залишків, харчових продуктів,  промислових матеріалів і виробів.  Загальне поширення: космополіт.

     Представники  А. terreus- звичайні компоненти агробіоцеінозів, можуть контамінувати різні харчові продукти (зернові, фрукти, овочі і т.д.) і промислові вироби в умовах підвищеної вологості. В регіонах тропічної та субтропічної зон, особливо в лісових грунтах. Зростає при різних температурах, але більш швидке та обільний ріст відмічений при 33,5-37,0°С. [1]

     Мешканці  грунтів, рослинних залишків; контамінують харчові продукти, промислові матеріали, вироби і конструкції. Продуценти органічних кислот, антибіотиків, токсинів. Патогенні для комах ,тварин і людини.

     А. terreus- один з найбільш активних цеплюлозоруйнуючих грибів, але здатний гідролізувати пальмову та кокосову олію, а також продукувати амілазу, ліпазу, метілестеразу та деполімеразу на різних субстратах рослинного походження, викликаючи їх деградацію. А. terreus на тирсі продукує целлобіазу, екзоглюкозідазу і ендоглюконазу, активність яких залежить від умов культивування.

     Знайшов широке застосування в промисловості  як продуцент ітаконовой кислоти, хоча при відповідній регуляції метаболізму  виділяє ще ряд органічних кіслот: лимонну, цис-аконітову, α-кетаглутарову, итатартарікову . Штами його легко мутують і піддаються направленому впливу при отриманні особливо активних продуцентів.

     Може  поселятися на різних кремнієвмісних  і металевих матеріалах, викликає поступове руйнування їх поверхні, що, очевидно, пояснюється здатністю до надсинтезу органічних кислот в екстримальних умовах. Електронно-мікроскопічні дослідження поверхні клітинної оболонки А. terreus показали, що ультроcтруктурна організація її змінюється в залежності від субстрату культивування. Клітини міцелію, вирощеного   на розчинних  субстратах ( глюкози, Na-КМЦ) в логарифмічній фазі зростання мають гладку поверхню. При рості на твердому нерозчинному субстраті (соломі) клітини секретірують речовину  полісахаридної природи, утворюють не поверхні густу фібрилярну сітку.

     З усіх числених його різновидів в даний  час визнають тільки дві – А. terreus var.aureus  и A. terreus var. Africanus.

     Ознаки  для розпізнавання різновидів А. terreus

1 A. terreus var. Africanus. Від основного виду відрізняється тим, що зростає швидше і широко при 24-26 ° С, утворює щільний субстратний міцелій і склероціеоподібні структури, що надають колонії характерний вигляд.

2 А. terreus var.aureus.   Виділення цієї форми засновано на зміні кольору колонії в період її формування. [1] 

    Особливості розмноження. Для Аspergillus terreus характерним є безстатеве розмноження – за допомогою конідій. Часом зустрічається статевий процес. На рис. 4 показано процес безстатевого (за допомогою конідій) та статевого розмноження у вищих грибів — аскоміцетів. За статевого розмноження на міцелії утворюються гаметангії 2, які складаються з антеридія (містить "+" – ядра, чоловіча статева клітина) та аскогонія (містить "-" – ядра, жіноча статева клітина). В аскогонії ядра з'єднуються попарно, але не зливаються. Із заплідненого аскогонія утворюються аскогенні двоядерні гіфи 3, а пари ядер піддаються мітозу, за якого реплікуються нові парні хромосоми. Далі в кінчиках аскогенних гіфів 4 відбувається каріогамія, після чого диплоїдні ядра піддаються мейозу. В результаті утворюються вісім гаплоїдних ядер, які розвиваються в аскоспори і розміщуються в аску 4. Одночасно аски, вміщені в міцеліальні гіфи, перетворюються в аскокарп 5. Аскокарп розпадається на окремі аски, які містять вісім аскоспор. Аскоспори проростають, утворюючи новий міцелій.[7]

                

Рис.4. Статевий процес

      Фізіолого-біохімічні ознаки. За типом живлення Aspergillus terreus є хемоорганогетеротрофом. Він є облігатним аеробом і не може існувати без кисню, джерелом якого є атмосферне повітря. Важливе значення для процесів життєдіяльності грибів має рН. Для більшості оптимальним є рН 3,0 – 4,0 . Залежно від рН можуть змінюватися культуральні та морфологічні ознаки: забарвлення середовища і колоній, характер росту міцелію, розміри  та форма органів розмноження, впливає на фізіологічну активність грибів. В ході культивування рН може змінюватися завдяки виділенням з клітини метаболітів і ферментів. Оптимальна температура росту для грибів Aspergillus terreus складає 25 – 35 С. Для грибів є характерним вплив світла на ріст міцелію, спороутворення, метаболічні та інші морфологічні процеси грибів. Пряме світло інгібує ріст грибів. Чергування  освітлення і темряви стимулює ріст. При цьому спостерігаються деякі періоди адаптації при переході  від росту при освітленні до росту в темноті і навпаки. Світло теж впливає на синтез нуклеїнових кислот, білка, компонентів клітинної оболонки і пігментів. Світло різного спектрального складу  по різному впливає на ріст і спороутворення різних грибів. Гриби є досить стійкими до дії радіації, але певні дози іонізуючого та УФ випромінювання можуть викликати мутації.[7]

2. Розрахунково – графічна частина

 

2.1. Розділ 1«Визначення показників швидкості росту при періодичному культивуванні мікроорганізмів»

Завдання 1. Визначити (рис. ):

- швидкість росту (µ) між 24 та 32 год. культивування;

- рівень біомаси;

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація сахарози в середовищі становить 0.09М;

- тривалість лаг-фази.

                                                                                               

Рис.5. Крива росту бактеріальної популяції 

     Визначення  основних параметрів кривої росту (концентрації біомаси, швидкості росту та тривалості лаг-фази) наведено на рис.6, 7.

     Швидкість експоненційного  росту – це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Її визначають за формулою

     

                 

де lg e = 0,43429.

                           

     Рис.6. Параметри росту: А – біомаса; Б – швидкість росту; В – тривалість лаг- фази 

     Згідно  з умовою t = 32 а t₀ = 24 год. Визначаємо за графіком (див. рис. 7) концентрацію біомаси у момент часу t та t₀: Х_t = 4 г/л; Х₀ = 2,8 г/л.

     Отже,

µ = (ln 4-ln 2,8)/(32-24)=0,046 год^-1

     Рівень  біомаси (концентрація біомаси) – це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

Х=Х_макс – Х₀ .

     Цю  величину виражають у граммах (міліграмах) сухої речовини, яка міститься у літрі (мілілітрі) культуральної рідини або клітинної суспензії.

     Згідно  з наведеним графіком вихідний рівень біомаси становить 0,33 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту – 8,0 г/л. Отже, згідно з наведеним рівнянням концентрація біомаси становить 8,0-0,33=7,67(г/л ).

     Економічний коефіцієнт. Важливим показником періодичного процесу є відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату – Х/S. Якщо ці дві величини виражені у вагових одиницях, як в нашому завданні, то відношення Х/S називають економічним коефіцієнтом (Y). Якщо врожай у грамах відноситься до кількості молей спожитого субстрату, то отриману величину називають молярним економічним коефіцієнтом.

     Згідно  з умовою, початкова концентрація сахарози в поживному середовищі (S) становить 0,09М або 0,09×342=30,78 г/л. Рівень біомаси – 7,67 г/л. Отже, економічний коефіцієнт Y=Х/S = 7,67/30,78 =0,249 або 24,9%.

     Тривалість  лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом t_r, в який культура досягла певної біомаси Х_r, і моментом часу t_t, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби одразу ж після інокуляції починався експоненційній ріст. 

Рис. 7.  Розрахунок тривалості лаг-фази

     Для визначення тривалості лаг-фази на кривій росту (рис. 7) проводимо теоретичну пряму, паралельно тій частині кривої, що відображає експоненційний ріст культури. Тривалість лаг-фази визначають за формулою

 Т = t_r  - (ln Х_r – ln Х₀)/ µ ),

 де

 µ =(ln Х_r – ln Х_t)/( t_r – t_t).

     За  умовою Х₀ = 0,33 г/л; приймають Х_r таким, що дорівнює 2 г/л. На реальній та теоретичній кривій визначають час t_r та t_t потрібний для досягнення 2,0 г/л біомаси: t_r =19,0 год , а t_t =10,0 год .

     Розрахуємо  швидкість росту в період даного проміжку часу, при умові, що

Х_t=0,6 г/л , Х_r=2,0 г/л Отже, швидкість  росту:

µ = (ln 2,0 – ln 0,6)/(19,0-10,0)=0,134 год^-1;

     Знаючи  швидкість росту на даному проміжку, розраховуємо тривалість лаг-фази: Т =19,0– ((ln 2,0 – ln 0,33)/0,134) =7,66 год.

     Отже, тривалість лаг-фази становить 7,66 год.

     Завдання 2. Визначити константу швидкості поділу (v) та тривалість генерації(g), якщо початкова концентрація клітин становить 10⁴, а через 8 год–10⁹

     Бактерії  розмножуються бінарним поділом, тому їхня кількість збільшується в геометричній прогресії: 2º→2¹→2²→2³→… 2ⁿ.

     Якщо  на одиницю об’єму періодичної культури, що росте, припадає N₀  клітин, то після n  поділів кількість клітин стане N₀×2ⁿ. Логарифмуючи, отримаємо: lg N= lg N₀+ n×lg2, звідки кількість клітинних поділів:

n= (lg N- lg N₀) / lg2.

     Кількість клітинних поділів за 1 год. (константа швидкості поділу v ) визначають за формулою:

v= n / t = (lg N- lg N₀) / lg2×(t- t ₀).

     Тривалість  генерації (час, необхідний для одного циклу поділу) визначають за  формулою:

g= t / n = 1/ v.

     Якщо  за 8 годин кількість клітини у середовищі збільшується з 10⁴  до 10⁹, то константа швидкості поділу

     v= (lg10⁹ -lg10⁴) / 0,3010×8 = 2,08 год^-1.

     Тривалість генерації g=1/ 2,08=0,48 год