Метод микрофлуориметрии

Московский  государственный университет им. М.В. Ломоносова

Биологический факультет

Кафедра биофизики

 

 

 

Отчёт по задаче малого практикума

 

«Метод микрофлуориметрии»

 

 

студентов : Никитиной Валентины

Ленбаум Валерии

Тесленок Елены

Преподаватель: Туровецкий В.Б.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Москва, 2012 год

Теоретическая часть

Метод флуоресцентных зондов дает уникальную возможность проведения многостороннего анализа механизмов регуляции клеточной активности. На сегодняшний день существует два варианта применения метода флуоресцентных зондов:

1. флуориметрия клеточных суспензий;
2. микрофлуориметрия одиночных клеток.

В этом методе используются специально разработанные приборы – проточные флуориметры, а также специальные красители (флуорохромы).

С помощью этого метода мы можем  узнать:

• количество рецепторов;
• микровязкость мембраны;
• концентрацию ионов Н⁺;
• концентрацию свободного Са²⁺;
• концентрацию связанного Са²⁺;
• концентрацию АФК;
• потенциал на мембране;
• целостность мембраны;
• внутриклеточный рН и другие параметры.

Флуориметрический метод определения внутриклеточного рН с использованием флуоресцеиндиацетата.

Принцип метода состоит в том, что незаряженная, бесцветная молекула флуоресцеиндиацетата легко проникает из окружающего раствора внутрь клетки, где внутриклеточные эстеразы расщепляют ее до флуоресцеина, находящего при разных значениях рН в разных формах, спектральные характеристики, которых существенно различаются. Определение значения внутриклеточного рН проводится по калибровочной кривой (величина параметра против соответствующего значения рН раствора).

Флуориметрический метод определения целостности плазматической мембраны с использованием этидиума бромида.

Принцип метода состоит в том, что этидиум бромид проходит через поврежденные клеточные мембраны и интеркалирует  в ДНК и РНК, образуя флуоресцирующий ярко-красный комплекс в ядре. Поскольку флуорохром не проходит через интактные клеточные мембраны, этидиум бромид является эффективным красителем для выявления нежизнеспособных клеток.

В результате одновременного применения этих методов (т.е. использование обоих  красителей ФДА и ЭБ) живые клетки в препарате светятся ярко-зеленым  светом, а нежизнеспособные – ярко-красным.

 

 

 

Практическая часть

Цель работы: Освоение теоретических и практических основ микрофлуориметрического метода определения внутриклеточного рН в одиночных перитонеальных фагоцитах мышей.

Ход работы и их обсуждение: Сначала нами были измерены интенсивности флуоресценции урановой стеклянной пластинки при длинах волн 520 нм и 570 нм, а так же вычислено их соотношение (Табл. 1)

Таблица 1. Показатели флуоресценции уранового стекла

I520, отн.ед.	I570, отн.ед.	I520/I570
0,325	0,29	1,12
0,317	0,284	1,12
0,328	0,286	1,15

Не соответствие последнего результата с предыдущими можно объяснить не достаточным прогревом ФЭУ.

Затем те же параметры были измерены для  растворов с различными значениями рН, содержащих флуоресцин (Табл. 2).

Таблица 2. Параметры флуоресценции  растворов с различным рН

рН	I520, отн.ед.	I570, отн.ед.	I520/I570
7,56	0,183	0,155	1,18
	0,213	0,179	1,19
6,37	0,388	0,342	1,13
	0,434	0,395	1,10

Далее была построена калибровочная кривая зависимости коэффициента К от рН раствора.

График зависимости отношения  интенсивностей флуоресценции от рН раствора.