Ферменты

Ферменты

Возможность проведения различных  манипуляций с ДНК in vitro всецело зависит от наличия очищенных ферментов, которые специфическим образом разрезают, модифицируют и соединяют молекулы. В настоящее время отсутствуют чисто химические методы, с помощью которых можно было бы осуществлять перестройку молекул ДНК с такими селективностью и разнообразием, которые характерны для ферментативных реакций. В то же время даже с помощью довольно небольшого числа ферментов можно получать рекомбинантные молекулы ДНК. Большинство этих ферментов были открыты при обстоятельствах, не связанных с их использованием при манипулировании с молекулами ДНК. На самом деле каждый фермент играет важную роль катализатора в том или ином химическом процессе, протекающем в организме, из которого он выделен. Использование ферментов в качестве инструмента при манипулировании с ДНК зависит, в частности, от их доступности и стабильности, а особенно от их чистоты, и прежде всего от того, свободны ли они от примесей, влияющих на ферментативную активность.

Разные экзонуклеазы расщепляют цепь предпочтительно либо с 5'-, либо с 3'-конца, но иногда они не проявляют такой специфичности. Эндонуклеазам свободные концы не требуются, поэтому данные ферменты могут гидролизовать кольцевые молекулы ДНК. Разрезание осуществляется по внутренним фосфодиэфирным связям, при этом образуются фрагменты разной длины. С помощью экзонуклеаз тоже могут образовываться короткие полинуклеотидные фрагменты, однако конечным продуктом во многих случаях являются нуклеозидмонофосфаты, поскольку экзонуклеазы осуществляют гидролиз, отщепляя последовательно один остаток за другим.

Наконец, нуклеазы отличаются одна от другой по тому, с какой стороны  от межнуклеотидного фосфодиэфирного мостика осуществляется гидролиз. Одни ферменты делают разрез между фосфатом и 3'-гидроксильной группой с образованием 5'-фосфомоноэфирных продуктов, другие - между фосфатом и 5'-гидроксильной группой.

Нуклеазы

а. Общие свойства

Нуклеазы позволяют специфическим  образом модифицировать молекулы ДНК  и РНК. Каждый фермент может быть отнесен к тому или иному классу в соответствии с его специфичностью или типом реакции, которую он катализирует. Так, ряд ферментов, подобно  рестриктирующим эндонуклеазам, действует только на ДНК. Другие, подобно панкреатической РНКазе, гидролизуют только РНК. Есть ферменты, которые используют в качестве субстратов как ДНК, так и РНК. Одни нуклеазы предпочтительно действуют либо на двухцепочечные, либо на одноцепочечные полинуклеотидные субстраты, другие не проявляют такой выраженной предпочтительности.

Нуклеазы можно также  разделить на две следующие категории: экзонуклеазы и эндонуклеазы.

Большинство ферментов упоминаются  в тексте этой книги. Нуклеазы, отмеченные звездочкой, используются как рутинные реактивы в экспериментах по получению  рекомбинантных молекул ДНК и поэтому рассматриваются более детально.

б. Нуклеазы, специфичные в отношении одноцепочечной ДНК

Эндонуклеазы. Некоторые эндонуклеазы гидролизуют одноцепочечные молекулы ДНК примерно в тысячу раз быстрее, чем двухцепочечные. Такая специфичность используется во многих экспериментах - при конструировании рекомбинантных ДНК, при гетеродуплексном анализе и даже при анализе экспрессии генов. Некоторые реакции, катализируемые подобными эндонуклеазами.

Несколько разных эндонуклеаз такого типа были достаточно хорошо очищены и охарактеризованы, чтобы их можно было использовать в качестве реактивов. Одна из них, нуклеаза S1, получена из высушенных препаратов плесневого гриба Aspergillus oryzae; источниками двух других широко используемых ферментов являются Neurospora иMung beans. Каждый из этих трех ферментов проявляет максимальную активность и точность распознавания одноцепочечных и двухцепочечных молекул при определенных условиях. Все три фермента гидролизуют как ДНК, так и РНК. При разрыве фосфодиэфирных связей с помощью этих ферментов образуются 5'-монофосфатные и З'-гидроксильные концы.

Экзонуклеазы. Экзонуклеаза E. coli exo VII специфична в отношении одноцепочечных ДНК. Она обладает необычной экзонуклеазной активностью в том смысле, что инициирует отщепление как с 5'-, так и с З'-концов цепи, в то время как наиболее известные экзонуклеазы специфичны к какому-то одному концу. Продуктами гидролиза отдельных цепей экзонуклеазой ехо VII являются олигонуклеотиды длиной примерно 25 мономерных единиц, которые содержат 5'-фосфомоноэфирные концевые группы.

в. Нуклеаза Bal 31

Псевдомонада Alteromonas espejiana секретирует единственную дезоксирибонуклеазу, получившую название Bal 31. В отношении одноцепочечной ДНК, в том числе одноцепочечных участков двухцепочечной ДНК, Bal 31 ведет себя как эндонуклеаза, действуя аналогично другим эндонуклеазам, специфичным к одноцепочечным ДНК. Однако в отношении интактной двухцепочечной ДНК этот фермент проявляет экзонуклеазную активность, по-видимому, благодаря тому, что он способен распознавать локальные одноцепочечные участки. Bal 31 разрезает обе цепи на обоих концах дуплекса, т.е. осуществляет деградацию одновременно в направлениях 3' - >5' и 5'->3'. В результате двухцепочечная молекула постепенно укорачивается. Если эмпирически оценить скорость этого процесса, то с помощью фермента Bal 31 можно получать фрагменты ДНК нужной длины. Хотя укорочение разных молекул ДНК происходит несинхронно, получается набор фрагментов, длина которых близка к заданной. В результате исчерпывающего гидролиза с помощью Bal 31 промежуточные олигонуклеотидные продукты расщепляются до 5'-мононуклеотидов.

г. РНКазы Н

Существует группа ферментов, получивших название РНКазы Н потому, что они специфически расщепляют цепь РНК в гибридном дуплексе РНК-ДНК. РНКаза Н E. coliпредставляет собой эндонуклеазу, продуктами действия которой являются олигорибонуклеотиды с 5'-фосфомоноэфирными концами. Этот фермент широко используется как реактив. Клетки эукариот тоже содержат подобную эндонуклеолитическую РНКазу Н. РНКаза Н-экзонуклеолитическая активность присуща экзонуклеазе III E. coli и обратным транскриптазам, кодируемым ретровирусами. Экзонуклеаза III расщепляет РНК до 5'-нуклеозид-монофосфатов в направлении З'->5', а продуктами гидролиза цепи РНК с помощью обратной транскриптазы являются 5'-фосфорилированные олигорибонуклеотиды длиной от двух до десяти нуклеотидов.

Эндонуклеазы рестрикции

Эволюция наделила различные  виды бактерий уникальными эндонуклеазами, позволяющими им отличать их собственную ДНК от чужеродной. Тем самым природа снабдила ученых богатым набором высокоспецифичных реактивов для расщепления ДНК. При изучении ДНК большое значение имеют две важные особенности рестриктирующих эндонуклеаз. Первая связана с замечательной способностью фермента узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности в ДНК. Вторая состоит в том, что существует большое количество различных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых узнает специфическую последовательность.

а. Три типа эндонуклеаз рестрикции

Эндонуклеазы типов I и И. Ферменты, относящиеся к группе эндонуклеаз типов I и II, - это сложные белки, обладающие активностями рестриктирующей эндонуклеазы и метилазы. Эти интересные ферменты не используются, однако, при конструировании рекомбинантных молекул ДНК. Ферменты типа I связываются с ДНК в специфических участках и затем производят двухцепочечные разрезы на разном расстоянии от сайтов узнавания, варьирующем от 400 п.н. до 7 т.п.н. Для осуществления ферментативного гидролиза ДНК необходимы Mg²+, ATP и S_аденозилметионин. Последний активирует фермент. Разрезание сопровождается гидролизом АТР, при этом фермент утрачивает эндонуклеолитическую активность, но сохраняет АТРазную. Таким образом, эндонуклеазы типа I являются ДНК-зависимыми АТРазами. Кроме того, они представляют собой сайтспецифические метилазы, катализирующие образование 6_метиладениновых остатков в сайте узнавания. Например, сайтом узнавания для фермента из E. coli K12 является

5'-AACNNN NN N GTGC_3' 3_TTGNNNNNNCACG_5'

где N - любое основание, a N_комплементарное ему основание. Эндонуклеаза разрезает цепь на значительном расстоянии от сайта узнавания, но при этом метилирование с образованием 6_метил-аденина происходит в пределах этого сайта. Эндонуклеазная активность проявляется только при наличии полностью неметилированного сайта. Сайт узнавания для фермента E. coli K12 состоит из двух коротких специфических олигонуклеотидов, разделенных шестью-восемью неспецифическими парами оснований. Такая структура типична для сайтов узнавания ферментов типа I, обнаруженных у различных штаммов бактерий. Специфические олигонуклеотидные последовательности для разных ферментов различаются, но метилированные остатки А всегда находятся в одинаковых позициях.

Родственные системы рестрикции-модификации  типа I кодируются аллельными локулами геномов различных кишечных бактерий. С каждой системой связаны три сцепленных гена: hsdR, hsdM и hsdS, расположенные в порядке, соответствующем порядку транскрипции. Полипептидные продукты hsdM и hsdS транслируются с одной двухцистронной мРНК и вместе составляют метилазу. Первый из них обладает метилазной активностью, а второй осуществляет сайтспецифическое узнавание. Продукт гена hsdR обладает эндонуклеазной активностью. Все три полипептида содержатся в различных пропорциях в активных препаратах ферментов типа I.

Ферменты типа III, так же как и эндонуклеаза типа I, обладают нуклеазной и метилазной активностями. Однако, несмотря на то, что ферменты типа III активируются S_аденозилметионином и для своей работы требуют АТР, они не катализируют ее гидролиза. Эндонуклеазы типа III делают двухцепочечные разрезы в ДНК на расстоянии примерно 25 п.н. от своих сайтов узнавания. В присутствии АТР и S_аденозилметионина те же ферменты катализируют сайтспецифическое метилирование. Ферменты типа III_гетеродимерные белки. Их субъединицы кодируются двумя сцепленными генами, локализованными у некоторых штаммов Е. coli во внехромосомных геномах. Каждый такой ген представляет собой отдельную транскрипционную единицу. Один генный продукт узнает специфическую последовательность и обладает метилазной активностью, другой выполняет эндонуклеазную функцию.

Поскольку ферменты типа I не разрезают молекулы ДНК на репродуцирующиеся  фрагменты и эндонуклеазные активности ферментов типа I и III конкурируют с метилированием, ни один из них не используется в качестве реагента при получении рекомбинантных ДНК.

Эндонуклеазы типа II. Рестриктирующие эндонуклеазы типа II являются основным инструментом при конструировании рекомбинантных молекул ДНК и при анализе структуры ДНК. Эти ферменты способны узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности и связываться с ними, но в отличие от эндонуклеаз типов I и III они производят двухцепочечные разрезы по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на вполне определенном небольшом расстоянии от него. Один и тот же фермент разрезает данную молекулу ДНК с образованием одинаковых наборов фрагментов. Длина фрагментов определяется расстоянием между специфическими последовательностями, узнаваемыми этим ферментом. Ферменты типа II гидролизуют фосфодиэфирные связи между 3'-гидроксильной группой и фосфатом, в результате чего образуется 5'-фосфомоноэфирная группа с одной стороны от разрыва и 3'-гидроксильная группа - с другой.

Сайт узнавания и разрезания для рестриктирующей эндонуклеазы Eco RI. Разрезание происходит в два этапа: сначала гидролизуется одна цепь, потом - другая. При обычных условиях продуктами реакции являются два дуплексных фрагмента с комплементарными одноцепочечными концами. В условиях, способствующих стабилизации водородных связей между четырьмя нуклеотидами из разных цепей, фрагменты могут реассоциировать.

б. Типичная рестриктирующая эндонуклеаза типа II

Эндонуклеаза Eco RI. Широко используемая рестриктирующая эндонуклаза Eco RI разрезает ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'-GAATTC_3'. Как и в случае других рестриктирующих эндонуклеаз типа II, эта последовательность является палиндромом, т.е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятся одинаковые последовательности, читаемые в направлении 5'->3'. Eco RI гидролизует фосфодиэфирные связи между остатками G и А в каждой цепи. Поскольку эндонуклеаза Eco RI разрезает обе цепи в том месте, где встречается палиндромная последовательность 5'-GAATTC_3', молекула ДНК разрезается на характерный для нее набор фрагментов.

Липкие концы. Эндонуклеаза Eco RI производит ступенчатые двухцепочечные разрезы, при этом у образующихся фрагментов ДНК на концах образуются короткие комплементарные одноцепочечные хвосты из четырех оснований - 5'-ААТТ_3'. В зависимости от ионной силы раствора и температуры эти комплементарные хвосты либо остаются спаренными, либо денатурируют, и тогда образуются отдельные фрагменты с короткими одноцепочечными выступами на 5'-концах. При соответствующих условиях комплементарные хвосты воссоединяются. Одноцепочечные концы, образующиеся при расщеплении ДНК эндонуклеазой Eco RI, получили название липких,поскольку они способны спариваться друг с другом. Важным следствием образования ступенчатых разрывов является то, что фрагменты, получающиеся в результате обработки эндонуклеазой Eco RI двух разных ДНК, могут соединяться с помощью липких концов. При этом различия, затрагивающие двухцепочечные спиральные сегменты указанных ДНК, на процесс соединения не влияют.

Фермент. В отличие от рестриктирующих эндонуклеаз типов I и III ферменты типа II, подобные Eco RI, не катализируют метилирования. Метилазную активность проявляет другой белок. Активная эндонуклеаза Eco RI представляет собой димер, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей с мол. массой 31000. Исходя из гомодимерной структуры можно было бы ожидать, что фермент будет действовать симметрично на идентичные последовательности двух частей сайта узнавания и разрезать обе цепи одновременно. Однако на самом деле гидролиз происходит последовательно.

Белок взаимодействует с  участком около десяти пар оснований; шесть из них находятся в пределах сайта узнавания, остальные являются фланкирующими. Именно эти фланкирующие последовательности, по-видимому, определяют выбор цепи, которая будет разрезана  первой. Кроме того, фланкирующие пары оснований влияют на общую скорость разрезания в данном сайте узнавания, так что в разных сайтах одной  молекулы ДНК гидролиз осуществляется с разной скоростью. Были получены кристаллы  комплекса Eco RI и олигонуклеотида 5'-TCGCGAATTCGCG_3' и проведен их рентгеноструктурный анализ. Это позволило в деталях выяснить способ взаимодействия данного фермента и ДНК. Было установлено, что между двумя остатками аргинина и одним глутаматом, с одной стороны, и парами оснований в сайте узнавания _ с другой, образуются водородные связи, в результате чего происходит частичное раскручивание В-ДНК. О свойствах других рестриктирующих эндонуклеаз типа II известно значительно меньше, но, по-видимому, они аналогичны свойствам Eco RI.