Метаболизм гликогена

 
Цитратсинтаза. 
Первая реакция цикла - это конденсирование ацетилКоА и ЩУК. При этом продуктом реакции является цитрат. Кроме того, цитрат используется в транспорте ацетилКоА из митохондрии в цитоплазму, где он используется на синтез ЖК и холестерола. В дополнение надо сказать, что цитрат в цитоплазме активирует ацетилКоАкарбоксилазу, первый фермент синтеза ЖК, и ингибирует фосфофруктокиназу-1. Во внепечёночных тканях цитрат также требуется для синтеза кетоновых тел. 
Аконитаза. 
Изомеризация цитрата в изоцитрат посредством аконитазы - стереоспецифична, с миграцией ОН-группы от центрального углеродного атома на соседний. Аконитза - один из нескольких митохондриальных ферментов, которые в своём составе содержат негемовое железо. 
Изоцитратдегидрогеназа (ИДГ). 
Изоцитрат окислительно декарбоксилируется до альфа-кетоглутарата посредством фермента ИДГ. Известно два различных фермента ИДГ. ИДГ, который используется в цикле Кребса, как кофактор использует НАД+, в то время как другая ИДГ использует НАДФ+ как кофактор. Первый фермент обнаружен только в митохондриях, а второй - как в митохондрии, так и в цитоплазме. СО2, который образуется в этой реакции, идёт на синтез цитрата. 
Альфа-кетоглутаратДГ. 
Альфа-кетоглутарат декарбоксилируется до сукцинилКоА с помощью альфа-кетоглутаратДГ. В ходе этой реакции образуется второй моль СО2. 
СукцинилКоАсинтетаза. 
Катализирует реакцию превращения сукцинилКоА в сукцинат. При этом из ГДФ образуется ГТФ, процесс такой известен как субстратное фосфорилирование. 
СукцинатДГ. 
СукцинатДГ катализирует реакцию окисление сукцината в фумарат с последующим восстановлением ФАД. 
Фумараза. 
Под действием этого фермента образуется L-малат. 
МалатДГ. 
L-малат - специфический субстрат для МДГ, последнего фермента цикла Кребса. При этом происходит окисление малат в ЩУК с последующим восстановлением НАД+.

Глюконеогенез  
Глюконеогенез - синтез глюкозы из неуглеводных предшественников. Глюконеогенез необходим в мозге, яичках, эритроцитах и мозговом веществе почек, где глюкоза является единственным источником энергии. Однако, во время голодания мозг может получать энергию из кетоновых тел, которые превращаются в ацетилКоА.

Первоначально пируват под влиянием пируваткарбоксилазы  и при участии СО2 и АТФ карбоксилируется с образованием оксалоацетата (ЩУК). 
Пируваткарбоксилаза находится в митохондриях. Мембрана митохондрий непроницаема для образовавшегося ЩУКа. Последний здесь же в митохондриях восстанавливается в малат. 
Реакция протекает при участии митохондриальной НАД-зависимой малатдегидрогеназы. В митохондриях отношение НАДН2/НАД+ относительно высоко, и поэтому внутримитохондриальный ЩУК легко восстанавливается в малат, который легко выходит из митохондрии, проходя мембрану митохондрий. В цитоплазме же отношение НАДН2/НАД+ очень мало, и малат вновь окисляется в ЩУК при участии НАД-зависимой цитоплазматической малатдегидрогеназы.  
 
 
Субстраты глюконеогенеза  
Лактат - образуется в процессе анаэробного гликолиза в эритроцитах и клетках скелетных мышц. Превращение лактата в глюкозу происходитв результате работы цикла Кори. Значение - с участием цикла Кори конечные продукты гликолиза из эритроцитов и скелетных мышц транспортируется в печень и используются на синтез глюкозы.

Аланин - основная глюкогенная аминокислота. Превращение аланина в глюкозу  происходит в аланиновом цикле. В  скелетных мышцах пируват, образующий в ходе гликолиза, может превращаться в аланин. Аланин, образующийся в этих реакциях, является транспортной формой NH2-групп из мышц в печень, где они в конечном счёте включаются в молекулы мочевины и экскретируются. При поступлении аланина в гепатоциты он может превращаться в пируват и использоваться как субстрат в глюконеогенезе. Значение - Аммиак является чрезвычайно токсическим соединением и основное его количество обезвреживается в клетках печени (в орнитиновом цикле происходит связывание его в молекулу мочевины и затем экскреция). Аланин служит транспортной формой аммиака в печень, где осуществляется его обезвреживание. 
Другие аминокислоты. Только две аминокислоты (лейцин и лизин) не могут использоваться в процессе глюконеогенеза. Это строго кетогенные аминокислоты. Все остальные глюкогенные аминокислоты при своём метаболизме дают промежуточные продукты гликолиза или цикла Кребса. 
Глицерол. Образуется при катаболизме триацилглицеролов в клетках жировой ткани, выходит в кровь и затем попадает в печень, где под действием двух ферментов (глицеролкиназа и альфа-глицеролфосфатдегидрогеназа) превращается в фосфодиоксиацетон (ФДА), промежуточный продукт гликолиза. 
Пропионил-КоА. Бетта-окисление ЖК с нечётным числом атомов углерода и метаболизм некоторых аминокислот (валин, изолейцин, триптофан, метионин) сопровождается образованием пропионил-КоА, который может быть превращён в сукцинил-КоА (метаболит цикла Кребса) под действием двух ферментов: 
-пропионил-КоА-карбоксилаза (в качестве кофермента используется биотин - смотри витамин Н). 
-метилмалонил-КоА-мутаза (метилкобаламин в качестве кофермента - смотри витамин В12).

Суммарное уравнение: 
2ПВК + 4АТФ + 2ГТФ + 2НАДН + 2Н+ + 6Н2О = глюкоза + 4АДФ + 2ГДФ + 6Ф + 2НАД+ 
На синтез молекулы глюкозы из двух молекул пирувата расходуется 4АТФ и 2ГТФ. Процесс окисления ЖК поставляет энергию для глюконеогенеза. Для восстановительных этапов требуется две молекулы НАДН. 
Пируваткарбоксилаза, катализирующая первую реакцию, имеет аллостерического активатора - ацетилКоА.

 
 
Регуляция глюконеогенеза  
1).Репрессируется после приёма богатой углеводами пищи (под действием инсулина) и индуцируется при голодании, стрессе, диабете (под действием глюкокортикоидов). 
2).Процесс окисления ЖК стимулирует глюконеогенез. Стимуляция осуществляется через увеличение уровня ацетил-КоА. 
3).Реципрокная взаимосвязь: 
-ацетилКоА ингибирует пируватДГ и активирует пируваткарбоксилазу. 
-АТФ активирует фруктозодифосфатазу, АМФ - ингибирует. 
-фруктозо-2,6-дифосфат активирует фосфофруктокиназу-1 и ингибирует фруктозодифосфатазу-1.

Пентозофосфатный путь  
Значение пентозофосфатного пути (ПФП): 
1).Образуется НАДФН*Н+ (50% всей потребности организма), который используется в востановительных реакциях биосинтеза веществ, в реакциях микросомального окисления и как антиоксидант. 
2).Снабжает клетку рибозо-5-фосфатом, который используется для синтеза нуклеотидов и нуклеиновых кислот. 
Большое количество НАДФН*Н+ используется для синтеза жирных кислот, холестерола, желчных кислот и стероидных гормонов, поэтому в клетках печени, жировой ткани, лактирующей молочной железе имеется высокий уровень ферментов для ПФП. 
Кроме того, эритроциты используют ПФП для получения большого количества НАДФН*Н+, который используется в восстановлении глутатиона. 
Превращение рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды через активацию рибонуклеотид редуктазы (смотри синтез нуклеотидов) требует НАДФН*Н+ как источник электронов. Следовательно, в быстро пролиферирующих клетках необходимо большое количество НАДФН*Н+. 
Превращение углеводов по ПФП не требует присутствия О2.

 
Реакции ПФП идут исключительно  в цитоплазме. 
Окислительный этап главным образом предназначен для синтеза НАДФН*Н+. 
Неокислительный этап ПФП предназначен главным образом для получения рибозо-5-фосфата. Также на этом этапе идёт превращение 5-углеродных сахаров в 6-и (фруктозо-6-фосфат) и 3-углеродные (3-ФГА) сахара, которые могут быть использованы в гликолизе. 
Основные ферменты неокислительного этапа - это трансальдолаза и транскетолаза: 
-транскетолаза переносит 2х-углеродные группы (для этого требуется тиамин пирофосфат как кофактор - смотри витамин В1. 
-трансальдолаза переносит 3х-углеродные группы. 
Трансальдолазные и транскетолазные реакции обратимы. 
В конечном счёте 3 моля 5-углеродных сахара превращаются в 2 моля 6-углеродных и 1 моль 3-углеродных. Следовательно, 6 моль 5-углеродных сахара превращаются в 4 моля 6-угл. и 2 моля 3-угл. Но 2 моля 3-угл. - это 1 моль 6-угл., поэтому в сумме получается 5 моль 6-угл. 
Общая реакция: 
6 Гл-6-ф + 7Н2О + 12НАДФ+ = 5 Гл-6-ф + 6СО2 + 12 НАДФН*Н+ + 12Н+ + Фн  
Значение неокислительного этапа: 
-стабилизирует концентрацию фосфопентоз в клетке; 
-синтез фосфопентоз в клетке при тормржении окислительного этапа.

 
 
Регуляция  
Уровень регуляции - глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы. 
1). Регуляция активности: 
-изостерический ингибитор - НАДФН*Н+. Ингибирование снимается окислительным глутатионом. 
-аллостерический ингибитор - ацилКоА. 
-простагландины стимулируют активность ДГ окислительного этапа. 
2). Регуляция количества фермента: 
-инсулин стимулирует синтез.  
 
 

Эритроциты и ПФП  
Всего 3 пути обмена углеводов в эритроцитах: 
1).Гликолиз 
2).ПФП 
3).Метаболизм 2,3-дифосфоглицерата. 
Гликолиз снабжает эритроциты энергией АТФ для мембранных насосов и НАДНЧН+ для реокисления метгемоглобина ( Fe2+ = Fe3+). 
ПФП снабжает эритроциты НАДФН*Н+ для поддержание уровня глутатиона. Невозможность поддерживать уровень глутатиона в эритроцитах ведёт к ослаблению клеточной стенки и гемолизу. Глутатион удаляет Н2О2 через активность глутатион пероксидазы. 
2,3-дифосфоглицерат взаимодействует с гемоглобином, при этом понижается его сродство к О2.

Методы исследования белков и а-т

Этапы исследования структуры белка: 
1).Выделение белка из смеси в чистом виде. 
2).Определение N-концевой аминокислоты. 
3).Определение С-концевой аминокислоты. 
4).Определение аминокислотной последовательности.

 
Методы  разделения смеси белков 
1).Диализ (метод мембранных сил). 
Для этого используют полуроницаемые мембраны (целлофан, целлюлоза), диаметр пор которых варьирует в широких пределах. 
2).Гель-хроматография. 
Используеься гель с порами. Белки с маленьким размером заходят в поры, и скорость их прохождения больше. 
3).Аффинная хроматография. 
Основана на высоком сродстве белков к специфическим группам и молекулам. Колонка для аффинной хроматографии заполняется твёрдым носителем, поверхность которого содержит вещества, способные специфически связываться с анализируемыми белками (например белок лектин связывается с глюкозой). 
4).Ионно-обменная хроматография. 
Каждый белок имеет определённый заряд - положительный или отрицательный в определённом рН. Это свойство и лежит в основе ионной хроматографии. Для этого используют целлюлозу, которая заряжена либо отрицательно (катионный обменник) либо положительно (анионный обменник). Белки, которые имеют противоположный заряд по отношению к целлюлозе, сохраняются при прохождении раствора белков через колонку. Потом их отсоединяют с помощью элюентов. 
5).Адсорбционная хроматография. 
Разделение компонентов смеси (образца) основана на их различной сорбируемости на твёрдых адсорбентов. В качестве адсорбентов используют: 
-активированный древесный уголь; 
-гель фосфата кальция; 
-оксид аллюминия; 
-оксид кремния; 
6).Распределительная хроматография. 
Твёрдый носитель играет роль опоры для передвигающего с разной скоростью белка. Носители - силикагель, крахмал, плёнки. 
7).Ультрацентрифугирование. 
8).Электрофорез ( смотри методичку А.Д.Тагановича "Нуклеопротеины"). 
9).Изоэлектрофокусирование. 
Основано на проведение электрофореза в средах с градиентом рН. При этом точное месторасположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки.

Определение N-концевой аминокислоты 
Перед тем, как определять последовательность аминокислот в белке, необходимо удалить дисульфидные связи внутри пептидов и между другими пептидами. Для этого используют 2-меркаптоэтанол или дитиотреитол. Чтобы предотвратить обратное образование дисульфидных связей, белок надо обработать йодацетатной кислотой (алкилирует свободные сульфогидрильные радикалы). Методы: 
1).Метод Сенжера. Для этого используют 1-фтор-2,4-динитробензол (ФДНБ), который взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Такая аминокислота может быть отщеплена от белка и идентифицирована, т.к. имеет жёлтый цвет. Затем проводят электрофорез и сравнивают искомую аминокислоту со стандартами. 
2).Даксил-хлорид. Как и ФДНБ, даксил-хлорид взаимодействует с N-концевой аминокислотой в щелочных условиях. Анализ как по методу Сенжера, только даксилированные аминокислоты определяют посредством флюоресценции. 
3).Метод деградации Эдмана. При использовании этого метода аминокислотная последовательность в белке остаётся невредимой. Это имеет преимущество перед предыдующими методами, т.к. можно определить всю последовательность аминокислот в белке. При этом методе используют фенилизотиоционат (ФИТЦ).

 
Определение С-концевой аминокислоты 
1).Метод Акабори. Используется гидразин. Он расщепляет пептидные связи , не нарушая последовательность а-т в пептиде. Эту а-ту определяют с помощью ФДНБ. 
2).Ферментативные методы, Используются карбоксипептидазы, которые осуществляют разрыв пептидной связи с того конца пептида, где содержится свободная СООН-группа. Это приводит к освобождению С-концевой аминокислоты, природа которой может быть идентифицирована методом хроматографии.

 
Определение аминокислотной последовательности 
Для этого сначала проводят избирательный (частичный) (химический или ферментативный) гидролиз пептида на олигопептиды, последовательность а-т в которых может быть точно определена. 
Химические методы избирательного гидролиза основаны на применении таких химических реактивов, которые вызывают селективный распад пептидных связей, образованных определёнными а-тами, оставляя незатронутыми другие связи: 
-бромциан (по остаткам метионина) 
-гидроксиамин (меду аспаргиновой кислотой и глицином) 
-N-бромсукцинамид (по остаткам триптофана). 
Ферментативные методы - основаны на избирательном действии протеолитических ферментов, расщепляющих пептидные связи, образованные определёнными а-тами: 
-пепсин (фен-тир-глу) 
-химотрипсин (три-тир-фен) 
-папаин, субтилизин и др. 
Метод пептидных карт (метод отпечатков пальцев, метод Ингрена). 
Используется при определении сходства и различий гомологических белков по первичной структуре. 
Гомологические белки - это белки, которые выполняют одну и туже функцию, но различаются по структуре (норма и патология, локализованные в разных органах). 
Этапы: 
-оба белка (например от здорового и больного человека) расщепляют на пептиды с помощью пепсина, трипсина. 
-затем смесь пептидов наносят в виде пятна на угол листа фильтровальной бумаги. 
-проводят электрофорез в горизонтальном направлении и хроматографию в вертикальном. 
-полученные карты (их две) сравнивают. 
Этим методом определяется серповидно-клеточная анемия (глу - вал).