Спектрофотометричний метод визначення білка в молоці і молочних продуктах

 

 

Рис. 2.3

Модель гнучкої молекули білка

 

У розчині поліпептидний  ланцюг не має форми витягнутої нитки, а частково скручується в спіраль (закручування ланцюга при формуванні альфа – спіралі відбувається по зв’язках, позначених на (рис. 1.1 а),  стрілками) згортається в клубок, або глобулу. Утворення глобули можна пояснити наступним чином. У воді поліпептидний ланцюг намагається прийняти таку форму, при якій гідрофобні ділянки контактують один з одним, а гідрофільні з водою. В результаті молекула вигинається і згортається таким чином, що всі гідрофобні бічні ланцюги опиняються всередині глобули, а гідрофільні на її поверхні, ближче до води.

Якщо послідовність  амінокислот і поліпептидного ланцюга називають первинної структурою, то спіраль - вторинною, а глобулу - третинної структурою білка (коли декілька глобул об’єднуються певним чином в одні ціле, говорять про четвертинну структуру). Фізико-хімічні та біологічні властивості білків визначає саме третинна структура, утворення якої залежить від первинної структури білка.

 В  складних білках (протеїдах) на відміну від  простих білків (протеїнів) крім  білкової частини є ще й  додатковий компонент небілкової  природи, що впливає на властивості білка. Це можуть бути залишки фосфорної кислоти в фосфопротеїдах, жири і вуглеводи - в ліпо - і глюкопротеїдах тощо.

 При розчиненні  білків у воді утворюються  колоїдні розчини, які характеризуються  значною стійкістю. До факторів  стабільності білків відносяться заряд частинок (однойменно заряджені частинки відштовхуються одна від одної) і наявність водної оболонки (оболонка перешкоджає агрегації частинок). Розглянемо їх докладніше.

Вище було відзначено, що амінокислоти, що входять до складу білків, мають кислі карбоксильні групи і основні аміногрупи, які в розчині знаходяться в дисоційованому стані - відповідно у вигляді СОО^— і NН₃^—. Отже, білки подібно амінокислотам є амфотерними з'єднанями, тобто здатні проявляти як кислі, так і лужні властивості. Залежно від співвідношення груп СОО^— і NН₃^— молекули білка мають позитивний або негативний сумарний заряд, тобто знаходяться в формі катіона або аніону. У кислих розчинах внаслідок пригнічення дисоціації карбоксильних груп всі молекули білка заряджаються позитивно (форма катіона), в лужних розчинах за рахунок втрати протонів з аміногрупи - негативно (форма аніону).

Отже, при пропусканні  через розчин білка електричного струму його молекули будуть пересуватися до катода або аноду в залежності від знаку заряду. Поділ суміші білків методом електрофорезу і засновано на цій властивості. Лише при певному значенні рН розчину в так званій ізоелектричній  точці, позитивні і негативні заряди врівноважують один одного, тобто сумарний заряд молекул білка стане рівним нулю (ізоелектричний стан), та їх пересування в електричному полі припиняється. У такому стані молекули білка не відштовхуються одна від одної,  при зіткненні вони з’єднуються  і коагулюють.

Утворенню водної (гідратної) оболонки навколо білкових молекул сприяють гідрофільні групи білка. У ізоелектричній точці, природно, спостерігається мінімум гідратації білка, тобто його стійкість буде найменшою. Руйнування гідратних оболонок, що супроводжується осадженням білків, можна прискорити, додаючи в розчин водовіднімаючі речовини, наприклад нейтральні солі (сульфат амонію), а також спирт і ацетон. При цьому білок зсідається без порушення своєї природньої структури, тобто в так званому нативному стані.

На відміну від нейтральних  солей концентровані кислоти  і луги, солі важких металів, високі температури викликають необоротне осадження білка при значній зміні його структури і нативних властивостей. Такий білок називають денатурованним, а процес - денатурацією. У деяких випадках білок після денатурації відновлює свої структуру і властивості. Цей процес називають ренатурацією (рис. 2.4).

 

                            

 

Рис. 2.4

Схема оборотної денатурації  білка

 

2.2 Класифікація білків  молока.

 

Білки молока є найважливішим  і найскладнішим його компонентом. Їх вміст у молоці коливається від 2,9 до 4,0%. Білки молока - різноманітні за будовою, фізичко-хімічними властивостями, біологічними функціями. Вони є сумішшю різних фракцій з молекулярною масою вище 10 тис. За місцем синтезу або знаходження білків їх поділяють на специфічні для молока і неспецифічні. Специфічні білки синтезуються секреторними клітинами молочної залози. У молоці корови таких білків 85-90%.

Білки молока містять 20 амінокислот. До складу молока входять як циклічні, так і ациклічні амінокислоти. За полярністю радикала вони класифікуються на неполярні, незаряджені полярні і заряджені полярні. Основні білки молока порівняно з білками інших харчових продуктів містять багато лейцину, ізолейцину, лізину, глютамінової кислоти, а казеїни - багато серину й проліну.

За вмістом і співвідношенням  незамінних амінокислот білки молока належать до біологічно повноцінних  білків. Молоко містить більше 20 різних білків. Всі численні білки молока можна розділити на дві великі групи: казеїн (казеїни) і сивороткові білки. Для цього достатньо до знежиреного молока додати будь-яку кислому (оцтову, соляну та ін), тобто реакцію середовища зрушити в кислу сторону. При цьому казеїн випадає в осад при досягненні рН 4,6-4,7, а сироваткові білки залишаться в розчині.

Кожну групу білків, у свою чергу, можна розділити за допомогою електрофорезу, висолювання або інших методів на відповідну кількість компонентів (рис. 2.5). Основна частина білків молока представлена казеїнами - 75-85%. Казеїни - це гетерогенні білки, для яких характерна наявність ефірних зв'язків з фосфатами, високий вміст проліну, незначний вміст або відсутність цистеїну і низька розчинність при рН 4,0 - 5,0. Казеїни здатні зв'язувати воду. Ця властивість має важливе значення для формування консистенції молочних продуктів. У звичайному сирі міститься до 80%, а у твердому швейцарському - 30-35% води. Це зумовлено структурою міцел, яка є пористою і дозволяє проникати всередину міцел воді, хімозину та іншим ферментам. Отже, вода не тільки оточує міцелу казеїну у вигляді гідратної оболонки, але й заповнює більшу частину її об'єму.

Друга велика група - це сироваткові  білки (15-22% всіх білків). Термін «сироваткові білки» застосовують для опису групи білків, які залишаються розчиненими в молоці чи сироватці після осідання казеїнів при рН 4,6 і температурі 10°С.

 

Рис. 2.5 Класифікація білків молока

 

Сироваткові білки за вмістом незамінних амінокислот (лізин, триптофан, метіонін, треонін, цистеїн) є найбільш біологічно цінними, тому використання для харчових цілей  має практичне значення. В цю групу входять лактоальбуміни, лактоглобуліни, сироватковий альбумін і імуноглобуліни, протеозо-пентонна фракція.

Лактоглобулін - основний білок молока. Його частка становить  близько половини всіх сироваткових білків молока (або 7-12% загальної кількості білків). При нагріванні до температури +30 °С він розпадається на мономери, а при подальшому нагріванні молекули денатурують за рахунок утворення дисульфідних зв'язків. Встановлено, що лактоглобулін в нативному стані має властивість зв'язувати катіони, аніони, ліпідні сполуки. У кислому середовищі шлунка він стійкий до дії пепсину і хімозину, розщеплюється тільки в кишечнику. Очевидно, однією з важливих його функцій є транспорт у кишечник важливих для організму, що росте, кислотно-нестійких сполук.

Лактоальбумін. Його вміст  складає 2-5% загальної кількості  білків і займає в сироваткових білках друге місце за кількістю. Це гетерогенний білок, який містить головний та мінорні  компоненти. У молоці лактоальбумін  тонкодиспергований. Це гетерогенний білок, який містить головний та мінорні компоненти. Він не коагулює в ізоелектричній точці через високу гідротованість, не зсідається під дією сичужного ферменту.

Імуноглобуліни - ще один клас сироваткових протеїнів. За хімічною природою вони є високомолекулярними білками, що виконують функцію антитіл. Антитіла утворюються в організмі при введені сторонніх білків (антигенів). Імуноглобуліни володіють вираженими властивостями аглютинації - склеювання мікробів. Їх кількість у звичайному молоці - 1,9-3,3% від загальної кількості, а в молозиві - до 90% всіх сироваткових білків. У зв'язку з високою гетерогенністю імуноглобуліни суттєво відрізняються від решти сироваткових білків.

Протезо-пентонна фракція - найбільш термостабільна частина  білків, що не зсідається із знежиреного молока при рН 4,6 після нагрівання до 95-100°С протягом 20 хв. Протезо-пентонну фракцію виділяють 12%-ною ТХО кислотою. Ці білки складають 24% всіх сироваткових білків і 2-3% усіх білкових фракцій.

Всі копоненти казеїну  і сироваткових білків в даний час вивчені, відомі їх первинна, вторинна і третинна структури, фізико-хімічні властивості та біологічна роль.

 

2.3 Склад і властивості  казеїну

 

Казеїн є основним білком молока - його вміст складає 78-85% всіх білків, а масова частка в  молоці коливається від 2,1 до 2,8%. Він знаходиться у вигляді колоїдних частинок, або так званих міцел (від лат. міцела – крихітка, крупинка), що мають діаметр 40-300 нм та середню молекулярну масу 6 • 10⁸. Міцели (рис. 2.6) складаються з більш дрібних (діаметром 10-15 нм) субміцел, які формуються з молекул компонентів казеїну. На поверхні міцел є заряджені групи (сумарний заряд частинок однаковий і має негативний знак) і гідратна оболонка, тому при наближенні один до одного вони не з’єднуються і не коагулюють. Таким чином, частинки казеїну у свіжому молоці досить стійкі.

 

         

 

Рис. 2.6 Міцели казеїну:

а – схематичне зображення: 1 – субміцела; 2 – міцела; з –  гідратна оболонка;

в – під електронним  мікроскопом

 

Казеїн, виділений з  молока з допомогою кислоти, являє собою суміш декількох компонентів, або фракцій. Основними фракціями казеїну є  а_s -, β -, χ -,  γ - казеїн. Їх молекулярна маса майже не відрізняється і становить 19 000-24 000. а_s і β - казеїн не осідає при дії на нього іонами кальцію. Всі три фракції зсідаються при внесенні в молоко сичужного фермента.

γ -Казеїн представляє собою частину молекули β -казеїну, тобто утворюється при його розщепленні протеолітичними ферментами молока. Він, як правило, не входить до складу міцел казеїну і не осідає під дією сичужного ферменту.

Отже, при виробництві  сиру сичужним способом ми його втрачаємо  з сироваткою.

Подібно іншим тваринним  білкам казеїн має вільні аміногрупи (МН₂) і карбоксильні групи (СООН), причому кількість останніх в ньому переважає. Тому казеїн відноситься до кислих білків і має ізоелектричну точку при рН 4,6 - 4,7. Крім того, він містить ОН - групи фосфорної кислоти, тому що є не простим, а складним білком - фосфопротеїдом. До ОН-груп фосфорної кислоти і, можливо, до деяких СООН - груп кислих амінокислот казеїну приєднуються кальцій, магній, калій та натрій, що знаходяться в молоці. Таким чином, в молоці казеїн міститься у вигляді слабкої кислоти та її солей - в основному у вигляді казеїнату кальцію.

Необхідно відзначити, що до складу міцел казеїну поряд з казеїнатом кальцію входить колоїдний фосфат кальцію. Учені припускають, що з його допомогою субміцели якимось чином з'єднуються в міцели. Отже, міцели казеїну представляють собою складний білково-сольовий комплекс, який ще називають «казеїнаткальційфосфатним комплексом», або простіше - казеїновим комплексом ».

Концентрація казеїну  і розмір його частинок визначають швидкість зсідання та  міцність одержуваних при виробництві  кисломолочних продуктів та сиру білкових згустків. Впливає розмір часток і на термостійкість молока: чим дрібніше частинки, тим воно більше термостійке.

Відомо, що вміст казеїну  в молоці та розмір його часток залежать від породи та індивідуальних особливостей тварин. Вплив інших факторів вивчено  ще мало. Проте пошук шляхів збільшення кількості казеїну у молоці триває. Гідрофільні властивості нативного казеїну визначаються кількістю і видом груп, що мають здатність приєднувати воду. До них відносяться в основному гідрофільні групи бічних ланцюгів білкових молекул - карбоксильні, аміногрупи, гідроксильні і сульфгідрильні. Всі перераховані групи приєднують різну кількість молекул  води, наприклад, карбоксильні групи - більше, ніж аміногрупи, тощо. Отже, характер взаємодії казеїну з водою залежить від амінокислотного складу, а також від реакції середовища та концентрації в ньому солей, що обумовлюють кількість заряджених груп в білкових частинках.

Після теплової і механічної обробки молока або зсідання білків кислотою і сичуговим ферментом  гідрофільні властивості казеїну  змінюються внаслідок зміни структури білкових частинок і перерозподілу на їх поверхні гідрофільних і гідрофобних груп. Адже відомо, що гідрофільні властивості глобулярних білків зменшуються поблизу ізоелектричної точки і при їх агрегації після теплової денатурації. Крім того, великий вплив на гідрофільні властивості казеїну надають сироваткові білки молока, які взаємодіють з його частками в процесі теплової обробки. Сивороткові білки (навіть після денатурації) пов'язують воду більш активно в порівнянні з казеїном. Тому їх приєднання до міцелах казеїну підвищує його гідрофільні властивості. Це потрібно враховувати при виборі режимів пастеризації сировини - молока.

Для того щоб виділити казеїн, необхідно довести його до ізоелектричного стану або зруйнувати гідратні оболонки його модифікованих форм. З цією метою слід внести в молоко коагулянт - кислоту (кислотна коагуляція) або сичужний фермент (сичужна коагуляція). Осаджують казеїн (але рідше) і за допомогою хлориду кальцію (кальцієва коагуляція). Під їх дією казеїн не випадає в осад, а колоїдний розчин білка перетворюється на згусток, або гель, частинки білка з’єднуються одна з одною у ланцюжки і утворюють просторові сітки. Швидкість утворення згустків, їх властивості залежать способу коагуляції, температури, рН молока і тощо. Процеси гелеутворення відіграють важливк роль при виробництві кисломолочних продуктів і сиру.