Шпаргалка по "Микробиологии"

Цитотоксические CD8+ CTL способны убивать зараженные вирусами клетки при непосредственном контакте с ними. В месте контакта из CTL в мембрану клетки-мишени проникают порообразующие белки — перфорины, формирующие в мембране микроканалы, через которые в клетку-мишень проникают ферменты — фрагментины, вызывающие разрушение ядра клетки и ее гибель.

 

 

 

68.

Полимеразная цепная реакция ( ПЦР )

Основу метода составляет катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий определённого участка ДНК. Первоначально проводят отжиг — термическое разделение двухнитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки. Затем среду охлаждают и вносят праймеры (затравки), комплементарные нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции применяют синтетические праймеры — олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеоти-дов (например, дезоксинуклеотидтрифосфат), взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную tag-полимеразу (по названию бактерии Thermits aquaticus), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся двухнитевые молекулы ДНК снова подогревают. Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праимеры и снова повторяют процедуру подогрева и охлаждения; поскольку tag-полимераза термостабильна, то необходимость в её повторном внесении отсутствует (рис. 11-19). ПЦР позволяет получить большие количества изучаемого фрагмента ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК. Идентификацию копий ДНК проводят методом электрофореза. Метод полимеразной цепной реакции ( ПЦР ) лежит также в основе ДНК-идентификации личности, установления родства людей, выявления генов наследственных болезней и пр.

Рис. 11-18. Гибридизация нуклеиновых кислот: в растворах (А), на твёрдой основе (Б), сэндвич-гибридизация (Б)

 

Полимеразоцепная реакция (ПЦР), ИФА. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) -основаннана принципе многократного копирования (амплификации) определенного участка ДНК или РНК. ПЦР позволяет выявить малые фрагменты ДНК, характерные для определенного вида микробов, и точно идентифицировать этот вид. Постановка ПЦР включает следующие этапы: 1. Выделение ДНК (РНК) из исследуемого материала. Для этого клетки необходимо лизировать с помощью высокой температуры. Затем отде

лить ДНК от клеточных обломков и разрушить клеточные нуклеазы. 2. Копирование выделенных участков (копий) нуклеиновых к-от1. В результате нагревания до 94 -95°С двойная цепь ДНК разделяется на две отдельные цепи. 2. К одноцепочечной ДНК присоединяется праймер. Праймер - это последовательность из 15 - 30 нуклеотидов, комплементарная маркерному фрагменту ДНК (т. е., тому фрагменту, который есть только у определяемого возбудителя заболевания). З.Синтез (элонгация) -достраивание

второй цепи ДНК. ДНК-полимераза присоединяет нуклеотиды к праймерам, достраивая двухцепочечные фрагменты ДНК (~ при 72°С). Вновь синтезированные фрагменты  ДНК служат матрицей для синтеза  новых цепей в следующем цикле  амплификации - это и есть цепная реакция в ПЦР. 3. Определение (детекция) продуктов ПЦР чаще всего проводят при помощи электрофореза. В результате видна оранжевая полоска на уровне контрольной ДНК. Иммуноферментный анализ (ИФА) — основан на использовании

двух разных по специфичности моноклональных антител против двух разных антигенных эпитопов в составе искомого антигена. В лунки с иммобилизованными антителами против одного эпитопа добавляют материал, в котором ищут антиген. В процессе инкубации на твердой фазе образуется комплекс антиген—антитело. Затем лунки отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом антитела против другого эпитопа того же антигена. После повторной инкубации и отмывания от избыт

ка конъюгата антител с ферментом  определяют количество связавшихся антител по их ферментативной активности в присутствии субстрата с индикатором. На стадии выявления иммунного комплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизированных и меченых антител, что послужило поводом для широко распространенного в литературе названия "сэндвич"-метод .

 

69.

Антигенпрезентирующие клетки (АПК) 

В периферической лимфоидной ткани  имеются типы специализированных клеток, которые способны усваивать антиген и представлять его в иммуногенной форме на своей поверхности для распознавания. В основном это макрофаги , дендритные клетки и B-клетки. Все они получили название антигенпрезентирующих клеток . Функция этих типов клеток - представление ( презентация ) антигенных пептидов в комплексе с молекулами MHC , т.е. придание проникшему антигену иммуностимулирующих свойств.

Таким образом, антигенпрезентирующие  клетки, т.е. клетки, представляющие антиген, - это гетерогенная популяция лейкоцитов с весьма выраженной иммуностимулирующей активностью.

Определенные АПК играют центральную  роль в индукции функциональной активности хелперных T-клеток , какие-то взаимодействуют с другими клетками иммунной системы.

Антигенпрезентирующие клетки локализованы преимущественно в коже, лимфатических узлах ,селезенке , эпителиальном и субэпитеальном слоях большинства слизистых оболочек и в тимусе.

Относящиеся к ним клетки Лангерганса из кожи и других плоскоэпителиальных покровов тела мигрируют в виде "вуалевидных" клеток (с характерными, напоминающими теннисные ракетки, бербековыми гранулами в цитоплазме) по афферентным лимфатическим сосудам в паракортикальные области регионарных лимфоузлов. Там они взаимодействуют с многочислеными T-клетками и представляют собой уже интердигитатные (переплетенные) клетки (ИДК) (англ. interdigitating cell). Такая миграция обеспечивает эффективный механизм доставки нагруженных на них процессированных антигенов из кожи и слизистых оболочек к хелперным T-клеткам лимфоузлов. На этих АПК обильно экспрессированы белки MHC класса II , необходимые для презентации антигена хелперным T-клеткам.

Фолликулярные дендритные (развлетвленные) клетки (ФДК) , презентирующие антигены B-клеткам , содержатся в первичных фолликулах и вторичных фолликулах B-клеточных областей лимфоузлов, селезенки и лимфоидной ткани слизистых оболочек (ЛТС) . Прочно соединяясь десмосомами отростков и образуя стабильную сеть, они не мигрируют из мест своего расположения. ФДК не экспрессируют белки MHC класса II, но связывают антигены посредством рецепторов к компонентам комплемента ( CD21 и CD35 ), ассоциированными в данном случае с иммунными комплексами . Кроме того, ФДК экспрессируют рецепторы для Fcиммуноглобулинов .

Был обнаружен в центрах размножения внутри вторичных B-клеточных фолликулов другой вид АПК - дендритные клетки центров размножения , которые, в отличие от ФДК, экспрессируют белки MHC класса II и способны к миграции. В центре размножения они взаимодействуют с T-клетками .

АПК присутствуют в тимусе , представляя собой здесь, как и в лимфоузлах, интердигитатные клетки . Особенно велико их содержание в мозговой зоне тимуса. В этом органе, которому принадлежит основная роль в размножении и созревании T-клеток, ИДК, по-видимому, ответственны за устранение T-клеток, реагирующих на собственные антигены организма (отрицательная селекция ).

Большинство АПК образуется в костном мозге , хотя их гемопоэтический предшественник остается пока неизвестным. Например, через 100 суток после трансплантации костного мозга все клетки Лангерганса в коже реципиента имеют донорское происхождение.

Моноциты , активированные in vitro гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором и интерлейкином-4 , теряют способность к фагоцитозу и превращаются в АПК, приобретая морфологию дендритных клеток, и начинают экспрессировать белки MHC класса II. Относительно ФДК первичных и вторичных лимфоидных фолликулов предполагается, что они имеют мезенхимное, а не костномозговое происхождение.

Классические B-клетки обильно экспрессируют молекулы MHC класса II (особенно после активации) и способны, следовательно, расщеплять и представлять специфические антигены активированным T-клеткам.

Не относящиеся к иммунной системе  клетки организма в норме не экспрессируют  белков MHC класса II, но при индукции цитокинами , такими как интерферон-гамма и фактор некроза опухолей-альфа , некоторые типы соматических клеток, например, кератиноциты, тироциты и эндотелиоциты способны синтезировать продукты MHC класса II и презентировать антигены. Индукция этой "неуместной" экспрессии, вероятно, представляет собой элемент патогенезааутоиммунных заболеваний и хронических воспалительных процессов .

 

 

70.

 

Макрофáги (от др.-греч. μακρός — большой, и φάγος — пожиратель (синонимы: гистиоцит-макрофаг, гистофагоцит, макрофагоцит, мегалофаг-пожиратель)), полибласты, клетки мезенхимальной природы в животном организме, способные к активному захвату и перевариванию бактерий, остатков погибших клеток и других чужеродных или токсичных для организма частиц.

Функции макрофагов:

• фагоцитоз,

• распознавание и представление (презентация) антигенов,

• секреция медиаторов системы иммунитета (монокинов).

Фагоцитоз. Феномен фагоцитоза открыт в 1883 году И. И. Мечниковым (см. историю развития иммунологии).

Процесс фагоцитоза происходит в несколько  стадий:

1.Стадия хемотаксиса представляет собой целенаправленное движение макрофагов к объекту фагоцитоза (корпускулярный антиген), который выделяет хемотаксические факторы (бактериальные компоненты, анафилатоксины, лимфокины и т. д.).

2.Стадия адгезии реализуется 2 механизмами: иммунным и неиммунным. Неиммунный фагоцитоз осуществляется за счет неспецифической адсорбции антигена на поверхности макрофага. В иммунном фагоцитозе участвуют Fc-рецепторы макрофагов к иммуноглобулинам. В одних случаях макрофаг несет на своей поверхности антитела, за счет которых прикрепляется к клетке-мишени. В других - с помощью Fc-рецептора он сорбирует уже образовавшийся иммунный комплекс за счет свободных Fc-фрагментов антител. Антитела и факторы комплемента, усиливающие фагоцитоз, называют опсонинами.

3.Стадия эндоцитоза (поглощения). При этом происходит инвагинация мембраны фагоцита и обволакивание объекта фагоцитоза псевдоподиями с образованием фагосомы. В дальнейшем фагосома сливается с лизосомами и образуется фаголизосома.

4.Стадия переваривания. В эту стадию происходит активация лизосомальных ферментов, разрушающих объект фагоцитоза.

Различают завершенный и незавершенный  фагоцитоз. При завершенном фагоцитозе происходит полное переваривание и  бактериальная клетка погибает. При  незавершенном фагоцитозе микробные  клетки остаются жизнеспособными. Это  обеспечивается различными механизмами. Так, микобакгерии туберкулеза и  токсоплазмы препятствуют слиянию  фагосом с лизосомами; гонококки, стафилококки и стрептококки могут  быть устойчивыми к действию лизосомальных  ферментов, риккетсии и хламидии могут долго персистировать в  цитоплазме вне фаголизосомы.

Распознавание и представление антигенов макрофагами.

В результате фагоцитоза и переваривания  антигенов образуется большое количество низкомолекулярных антигенных фрагментов. Часть из них в виде пептидов перемещается на поверхность макрофага.

Если перевариванию подвергался  собственный АГ организма, то он связывается  с молекулами HLA I класса (HLA-A, HLA-B, HLA-C). Экзоантигены - пептиды длиной 12-25 аминокислот  связываются с молекулами 2 класса (HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ). Только после этого  они взаимодействуют с Т-хелперами. Таким образом, макрофаги представляют переработанный антиген Т-хелперам в комплексе со своими HLA антигенами (1-й сигнал).

Секреция медиаторов иммунной системы (монокинов). Вторым сигналом для активации  Т-хелперов является выделение макрофагами  интерлейкина I - монокина с многообразным  биологическим и пирогенным действием. Кроме этого, макрофаги выделяют другие медиаторы: ИЛ-3, 6, 8, 10, 15, фактор некроза опухоли (ФНО), простагландины, лейкотриены, интерфероны ? и ?, факторы комплемента, ферменты.

ИЛ-1 и ФНО - основные медиаторы макрофагов, выделяются под действием эндотоксина - липополисахарида многих видов бактерий, индуцируют синтез белков острой фазы воспаления, септический шок. Основным их свойством является провоспалительное  действие. Они стимулируют пролиферацию клеток-киллеров, направленных против опухоли, а также непосредственно разрушают многие клетки. ФНО увеличивает продукцию интерферонов, ИЛ-1 и ИЛ-2. Кроме этого, он оказывает и системное действие, в частности усиливает выделение гормонов гипоталамусом

 

74-75.

 

Серологические реакции— иммунологические методы, при которых по известному антителу (диагностические сыворотки) определяется неизвестный антиген или по известному антигену (диагностикум) — неизвестное антитело. 

Серологические исследования широко применяются при различных инфекционных заболеваниях, а также для установления групп крови и видовой принадлежности белка. 
В инфекционной патологии обнаружение в сыворотке крови больных антител к тому или иному виду возбудителя при отрицательном бактериологическом исследовании позволяет определить этиологию заболевания. В случае получения чистой культуры возбудителя с помощью соответствующих сывороток определяют его видовую принадлежность. 
Серологические реакции являются результатом взаимодействия (соединения) антигена (см.) с соответствующим антителом (см.), которое может проявиться как в условиях плотной среды (агаровый гель), так и жидкой. Они протекают в две фазы: 1) невидимая — непосредственное соединение антигена с антителом, 2) видимая — конечный результат реакции. Реакции проявляются в присутствии электролитов(0,85% раствор NaCl) при t° 37°. 
Большинство серологических реакций обладает высокой специфичностью. Однако при наличии у различных видов бактерий, вирусов, тканей так называемых общих антигенов могут наблюдаться неспецифические (групповые) реакции. 
К серологическим реакциям относятся: агглютинация (см.), преципитация (см.) в жидкостях и гелях, опсонофагоцитарная реакция, реакция нейтрализации (вирусов,токсинов) и реакция связывания комплемента — РСК (см. Борде—Жангу реакция) и ее модификации. Кроме того, применяется так называемая реакция иммобилизации, которая основана на том, что в случае взаимодействия антител с соответствующими подвижными видами микроорганизмов последние теряют способность к движению. Это явление служит показателем образования специфического комплекса антиген — антитело. 
Реакция агглютинации нашла широкое применение при диагностике туляремии, кандидоза, дизентерии, брюшного тифа (см. Видаля реакция), сыпного тифа (см. Вейля — Феликса реакция) и др. Реакция преципитации широкого применения в микробиологической диагностике не получила, исключение — реакция термопреципитации (см. Асколи реакция) и реакция диффузионной преципитации в геле, с помощью которой определяют токсигенность дифтерийных культур. Вместе с тем реакция преципитации широко применяется в судебной медицине и гигиене. 
Реакция нейтрализации основана на том, что специфическая иммунная сыворотка нейтрализует действие соответствующего антигена. 
Реакция связывания комплемента (РСК) широко применяется при диагностике сифилиса (см. Вассермана реакция), гонореи, риносклеромы, сапа, токсоплазмоза и др. 
Реакция иммобилизации применяется при диагностике сифилиса — реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ), а также холеры.