Фотометрические методы анализа

Оглавление

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА 1

ОСНОВНЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СВЕТОПОГЛОЩЕНИЯ. 2

СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ 4

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВА В РАСТВОРЕ. 4

МЕТОД ГРАДУИРОВОЧНОГО ГРАФИКА. 5

МЕТОД СРАВНЕНИЯ ОПТИЧЕСКИХ ПЛОТНОСТЕЙ СТАНДАРТНОГО И ИССЛЕДУЕМОГО РАСТВОРОВ. 6

ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРЫ. 7

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВА В РАСТВОРЕ С ПОМОЩЬЮ КФК-2. 9

     ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

     В фотометрических методах используют избирательное поглощение света  молекулами анализируемого вещества. Согласно квантовой механике свет представляет собой поток частиц, называемых квантами или фотонами. Энергия каждого  кванта определяется длиной волны излучения. В результате поглощения излучения  молекула поглощающего вещества переходит  из основного состояния с минимальной  энергией Ej в более высокое энергетическое состояние Е₂. Электронные переходы, вызванные поглощением строго определенных квантов световой энергии, характеризуются наличием строго определенных полос поглощения в электронных спектрах поглощающих молекул. Причем поглощение света происходит только в том случае, когда энергия поглощаемого кванта совпадает с разностью энергий ∆Е между квантовыми энергетическими уровнями в конечном (E₂) и начальном (Ej) состояниях поглощающей молекулы: 

     Здесь h - постоянная Планка (h = 6,625*10^-34 Дж*с); ν - частота поглощаемого излучения, которая определяется энергией поглощенного кванта и выражается отношением скорости распространения излучения с (скорости световой волны в вакууме с = 3*10¹⁰ см/с) к длине волны λ; . Частота излучения ν измеряется в обратных секундах (с^-1), герцах (Гц). 1 Гц = 1 с^-1.

     Длина волны λ измеряется в ангстремах (1 Å = 1*10^-8 см), микрометрах или микронах (1 мкм = 1 мк = 1*10^-6 м), нанометрах или миллимикронах (1 нм = 1 ммк = 10 Å = 1*10^-9 м).

     Энергия излучения характеризуется электромагнитным спектром, охватывающим область от километровых радиоволн до десятых  долей ангстрема γ- излучения и космических лучей. Для характеристики участка спектра часто используют также волновое число θ которое показывает, какое число длин волн приходится на 1см пути излучения в вакууме, и определяется соотношением:

     Природа полос поглощения в ультрафиолетовой (10-400нм) и видимой (400- 760нм) областях спектра одинакова и связана  главным образом с числом и  расположением электронов в поглощающих  молекулах и ионах. В инфракрасной области (0,8-1000 мкм) она в большей  степени связана с колебаниями  атомов в молекулах поглощающего вещества.

     В зависимости от используемой аппаратуры в фотометрическом анализе различают спектрофотометрический метод - анализ по поглощению монохроматического света и фотоколориметрический - анализ по поглощению полихроматического (немонохроматического) света в видимой области спектра. Оба метода основаны на пропорциональной зависимости между светопоглощением и концентрацией поглощающего вещества.

     Фотометрические методы подразделяют на прямые и косвенные. В прямых методах определяемый ион  М с помощью реагента R переводят в светопоглощающее соединение MR, а затем измеряют интенсивность светопоглощения раствора этого соединения. При косвенных определениях используют вспомогательные соединения, которые при взаимодействии с определяемым веществом либо разрушаются сами, либо образуют новые светопоглощающие соединения.

     ОСНОВНЫЕ  ЗАКОНОМЕРНОСТИ СВЕТОПОГЛОЩЕНИЯ.

 

     При прохождении через слой вещества (раствора) светового потока с интенсивностью I₀ его интенсивность в результате поглощения в слое, отражения и рассеяния уменьшается до значения I. Интенсивности падающего светового потока I₀ и светового потока I, прошедшего через раствор, можно определить экспериментально. При относительных измерениях поглощения света истинными растворами потерями излучения вследствие отражения и рассеяния обычно пренебрегают.

     Связь между интенсивностями световых потоков I₀ и I устанавливается законом Бугера-Ламберта, согласно которому однородные слои одного и того же вещества одинаковой толщины поглощают одну и ту же долю падающей на них световой энергии (при постоянной концентрации растворенного вещества).

     Математически этот закон выражается уравнением экспоненциальной зависимости: 

     где е - основание натуральных логарифмов; а - коэффициент поглощения; l - толщина поглощающего слоя.

     Отношение: 

     называют пропусканием; его значения могут изменяться от 0 до 1. Часто эту величину выражают в процентах. Если величина Т отнесена к толщине слоя в 1 см, то ее называют коэффициентом пропускания. Поглощение излучения характеризуют оптической плотностью: 

     Связь между концентрацией поглощающего раствора и его оптической плотностью выражается законом Бера, согласно которому оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества при постоянной толщине слоя:

     l

     где - коэффициент пропорциональности; С - концентрация растворенного вещества.

     Зависимость интенсивности монохроматического светового потока, прошедшего через слой окрашенного раствора, от интенсивности падающего потока света, концентрации окрашенного вещества и толщины слоя раствора определяется объединенным законом Бугера-Ламберта-Бера, который является основным законом светопоглощения и лежит в основе большинства фотометрических методов анализа: 

     где k - коэффициент светопоглощения, зависящий от природы растворенного вещества, температуры, растворителя и длины волны света.

     Если  концентрация С выражена в молях  на литр, а l - в сантиметрах, то k представляет собой молярный коэффициент светопоглощения при длине λ и обозначается В таком случае уравнение примет вид: 

     При соблюдении основного закона светопоглощения  оптическая плотность раствора прямо  пропорциональна молярному коэффициенту светопоглощения, концентрации поглощающего вещества и толщине слоя раствора: 

     При графическом изображении зависимости оптической плотности от концентрации (при постоянном значении 1) получается прямая линия. Эта прямая проходит через начало координат при отсутствии поглощения света растворителем и систематических погрешностей.

     Уравнения 4 и 5 выведены для монохроматического света, т.е. света определенной длины  волны, который может быть выделен  при помощи специального оптического устройства - монохроматора. В фотоколориметре измерение интенсивности световых потоков производят не в монохроматическом, а в полихроматическом свете, т.е. на довольно широком участке спектра - в интервале длин волн 20-100 нм. В этом случае в уравнении 5 вместо молярного коэффициента светового поглощения можно использовать значение среднего молярного коэффициента светопоглощения , зависящие от ширины полосы пропускания светофильтра

     СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ

 

     Спектр  поглощения, или, более корректно, абсолютный спектр поглощения вещества представляет собой зависимость количества поглощенного света от длины волны. Такие спектры  для красителей в видимой области (400-700 нм) имеют иногда несколько  максимумов. Спектры поглощения в  ультрафиолетовой (200-400 нм) и видимых  областях отражают переходы связанных  и несвязанных электронов в молекуле. Это обычно делокализованные π-электроны двойных С=С связей и неподеленные пары азота и кислорода. Поскольку, как правило, все электроны в молекуле при комнатной температуре находятся на нижнем энергетическом уровне, спектры в этой области дают информацию об основном и первом возбужденном электронных состояниях молекулы. Ввиду того, что длина волны поглощенного света соответствует определенному переходу, пики на спектрах поглощения вещества обусловлены присутствием в нем известных структур. Длина волны, при которой наблюдается максимальное поглощение света, обозначается через . Положение максимума спектра поглощения является важной оптической характеристикой вещества, а характер и вид спектра поглощения характеризуют его качественную индивидуальность. Группа в молекуле, которая дает вклад в спектр ее поглощения, называется хромофором. Такой группой является, например, карбонильная группа >С=О, существующая у всех аминокислот. Другим хромофором является пептидная группа полипептидных цепей. К основным хромофорам белка относятся остатки ароматических кислот: триптофан и в меньшей степени тирозин и фенилаланин. Спектр поглощения триптофана, обусловленный его индольным кольцом с системой сопряженных связей, обладает двумя полосами поглощения с максимумами при 220 и 280 нм. В нуклеиновых кислотах основными хромофорами являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания нуклеотидов. При образовании сопряженных связей в молекуле энергия возбужденного состояния электронов уменьшается, и, следовательно, хромофор начинает поглощать свет большей длины волны. Такой сдвиг в спектрах поглощения называется батохромным. Наоборот, сдвиг спектра в коротковолновую область именуется гипсохромным. Гиперхромный и гипохромный эффекты - это соответственно увеличение и уменьшение экстинкции. Обнаружить очень близко расположенные линии колебательных и вращательных переходов на спектрах молекул удается лишь при высоком разрешении (разрешением называется способность прибора различать две близко расположенные линии).

     ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ  КОНЦЕНТРАЦИИ ВЕЩЕСТВА В РАСТВОРЕ.

 

     Фотометрические методы определения концентрации растворов  основаны на сравнении поглощения при  пропускании света стандартными и исследуемыми растворами. Степень поглощения света фотометрируемым раствором измеряют с помощью фотоколориметров и спектрофотометров. Измерение оптической плотности стандартного и исследуемого окрашенных растворов всегда производят по отношению к раствору сравнения (нулевому (контрольному) раствору). В качестве раствора сравнения можно использовать аликвотную часть исследуемого раствора, содержащего все добавленные компоненты, кроме реагента, образующего с определяемым веществом окрашенное соединение. Если добавляемый реагент и все остальные компоненты раствора сравнения бесцветны и, следовательно, не поглощают лучей в видимой области спектра, то в качестве раствора сравнения можно использовать дистиллированную воду. 
 

     МЕТОД ГРАДУИРОВОЧНОГО  ГРАФИКА.

 

     Для определения содержания вещества методом  градуировочного (калибровочного) графика  готовят серию из 5-8 стандартных  растворов разных концентраций (не менее 3 параллельных растворов для  каждой точки).

     При выборе интервала концентраций стандартных растворов руководствуются следующими положениями:

     а) он должен охватывать область возможных изменений концентрации исследуемого раствора; желательно, чтобы оптическая плотность исследуемого раствора соответствовала примерно середине градуировочной кривой;

     б) желательно, чтобы в этом интервале концентраций при выбранных толщине кюветы 1 и аналитической длине волны λ (в большинстве случаев λ=λ_макс светопоглощающего соединения) соблюдался основной закон светопоглощения, т.е. график А = f(C) был линейным;

     в) интервал рабочих значений λ соответствующий интервалу стандартных растворов, должен обеспечивать максимальную воспроизводимость результатов измерений.

     При совокупности перечисленных условий  измеряют оптические плотности стандартных  растворов относительно растворителя и строят график зависимости А = f(C). Полученная кривая называется градуировочной или калибровочной и имеет вид прямой выходящей из начала координат. Экстраполировать калибровочную прямую к значениям оптических плотностей, лежащим выше последней экспериментально полученной точки, не рекомендуется. Периодически (раз в неделю или реже) калибровочную кривую проверяют по 2-3 свежеприготовленным стандартным растворам. Калибровочные графики, построенные с реактивами разных партий, как правило, не совпадают. Поэтому при смене реактивов график необходимо построить заново. График, построенный при работе на одном приборе, нельзя использовать для расчетов результатов, полученных на другом.