Селекция микроорганизмов

     Энергия кислотообразования для Lac. lactis должна составлять 4-6 ч, для - Lac. cremoris 5-7 ч, Lac. diacetylactis должен свертывать молоко через 16-24 ч, а Lbm. acidophilum- через 4-5 ч.

     Штаммы  термофильных стрептококков и болгарской палочки отбирают средней и высокой  активности свертывания. Штаммы Str. thermophilus высокой активности молоко свертывают через 3,5-4 час, штаммы средней активности образуют сгусток через 5-7 час. Активные штаммы болгарской палочки свертывают молоко через 3-3,5 час, а штаммы средней активности - через 5-7 час. Термофильный стрептококк и болгарская палочка используются в симбиотической закваске для кисломолочных продуктов «южного» типа.

     Активностъ свертывания и органолептические свойствa выделенных штаммов являются наиболее важными и решающими показателями, определяющими пригодность их для использования в производстве. Кроме того, мезофильные молочнокислые стрептококки оценивают по следующим тестам: резистентность к бактериофагу, рост в лакмусовом молоке при температуре 45°С, образование аммиака из аргинина, образование диацетила, ацетоина и углекислого газа (для ароматобразующих стрептококков), способность к подавлению термоустойчивой молочнокислой палочки.

     Для использования в производстве отбирают штаммы всех видов мезофильных молочнокислых  стрептококков, не дающих роста в  лакмусовом молоке при 45°С, резистентные к поливалентному бактериофагу и  нелизогенные, подавляющие рост и  кислотообразующую способность термоустойчивой молочнокислой палочки.

     Штаммы, образующие аммиак из аргинина, не продуцирующие  диацетила, ацетоина и углекислого  газа, относят к Lac. lactis.

     Штаммы, не образующие аммиака из аргинина, не продуцирующие диацетила, ацетоина и углекислого газа, относят к Lac. cremoris

     Штаммы, образующие диацетил, ацетоин, углекислый газ и аммиак из аргинина, относят  к ароматобразующему виду Lac. diacetylactis.

     Для использования в производстве отбирают штаммы термофильного стрептококка, не развивающиеся в молоке с пенициллином (0,01 МЕ/см ), развивающиеся в гидролизованном молоке в присутствии не более 2 % NaС1 и 0,1 % метиленового голубого.

     Из  термофильных молочнокислых палочек  в производстве используют штаммы, дающие рост в молоке при 45 °С и не растущие при температуре 15°С, имеющие предел кислотообразования 200-250 °Т.

     Кроме того, штаммы ацидофильной палочки  должны быть устойчивыми не менее  чем к 0,4 % фенола, 20 % желчи, рН среды 8,3 и обладать выраженной антибиотической  активностью по отношению к гнилостной микрофлоре, стафилококку, палочке протея и кишечным палочкам. Штаммы болгарской палочки должны образовывать ацетальдегид.

     Исследование  выделенных штаммов по вышеперечисленным  гестам дает возможность идентифицировать их до вида. Из проверенных и отобранных ценных штаммов молочнокислых бактерий составляют коллекцию, которую сохраняют путем пересевов штаммов в стерильное молоко не реже одного раза в месяц. При этом штаммы нередко снижают свою биохимическую активность (пассажная спонтанная изменчивость). Поэтому 1-2 раза в год штаммы проверяют по их активности, чистоте, биохимическим и органолептическим свойствам.

     Отобранные  производственно-ценные штаммы молочнокислых  бактерий можно хранить также  в замороженном виде при -18 - (-25)°С в  течение 4-6 мес или в высушенном состоянии после сублимационной сушки. В последнем случае запаянные ампулы с сухими культурами выдерживают хранение при низкой положительной (3-5°С) или отрицательной (-18 - (-25 °С) температуре в течение нескольких лет (до 10 и более). 

     V. ПРИНЦИПЫ ПОДБОРА КУЛЬТУР В СОСТАВ ЗАКВАСОК 

     Важным  показателем качества закваски является ее пригодность для производства заданного продукта, что должно быть проверено исследованиями в производственных условиях.

     При составлении заквасок необходимо учитывать специфические свойства вырабатываемого продукта, температурные режимы производства, взаимоотношения между микроорганизмами, возможность развития бактериофага и др.

     В зависимости от назначения в состав заквасок вводят штаммы, обладающие определенными особенностями. Так, закваски для производства масла должны иметь свойства кислото- и ароматобразования, незначительную протеолитическую активность. Для масла, предназначенного для непосредственного использования, подходят закваски D и LD, поскольку желательно быстрое и сильное ароматобразование. Для масла, предназначенного для длительного хранения, больше подходят закваски L, поскольку в этом случае необходим постоянный мягкий аромат. Для простокваши и сметаны наиболее пригодными считаются закваски D, так как желательно быстрое ароматобразование. В эти закваски подбирают штаммы, образующие при свертывании молока сгустки вязкой консистенции без отделения сыворотки.

     При составлении закваски для творога  вводят штаммы, сообщающие продукту хорошие  вкус и запах, образующие сгустки, легко отделяющие сыворотку.

     Для получения кисломолочных продуктов  с лечебными свойствами в состав закваски вводят ацидофильные палочки и бифидобактерии, образующие антибиотические вещества. В состав заквасок для сыров вводят молочнокислые бактерии, обладающие относительно высокой протеолитической активностью, придающие специфические вкус и аромат продукту.

     При составлении заквасок необходимо учитывать  также температурные режимы производства молочных продуктов. Если процесс осуществляется при 20-30 °С, то в закваску вводят преимущественно мезофильные микроорганизмы, а при 40-45 °С -термофильные.

     Важнейшим критерием годности для объединения  отдельных штаммов в многоштаммовые закваски является сочетаемость видов и штаммов. По возможности должны произойти взаимная стимуляция заквасочных микроорганизмов и антагонистическое действие, т. е. подавление развития посторонней нежелательной микрофлоры.

     Антагонистическое действие штаммов может иметь  несколько причин: образование антибиотиков, продуктов обмена, оказывающих ингибирующее действие; разная скорость адаптации штаммов к конкретной питательной среде; темп размножения (продолжительность генерации)и др.

     На  основе использования антагонизма  были созданы низиновые и антагонистические  закваски. Низиновые закваски составляют штаммы Lac. lactis, образующие антибиотик низин, который препятствует прорастанию спор маслянокислых бактерий.

     В состав антагонистической закваски входят штаммы Lbm. plantarum, кохорые образуют незначительные количества пероксида водорода, задерживающего развитие маслянокислых бактерий. В закваску для творога вводят штаммыLac. cremoris, образующие антибиотик диплококцин, ингибирующий развитие кишечных палочек.

     Чтобы избежать антагонистического воздействия  на заквасочные штаммы, проводят предварительный отбор их комбинаций по основным органолептическим параметрам. Как и в случае с отдельными штаммами, комбинации проверяют на пригодность и постоянство признаков.

     Для производства отбирают многоштаммовые закваски, у которых в результате большого количества пассажей установилось равновесие признаков и штаммов.

     Штаммы, вводимые в состав заквасок, проверяют  на чувствительность к бактериофагам. Для проверок используют широко распространенные бактериофаги, известные своей агрессивностью к многочисленным штаммам. В питательную среду (плотную или жидкую), инфицированную бактериофагом, высевают проверяемый штамм бактерий. При этом, если наступает лизис бактерий, на плотной питательной среде появляются зоны просветления, так называемые негативные колонии, в которых нет роста бактерий. В жидких средах чувствительные к бактериофагу штаммы бактерий не развиваются (нет помутнения) или происходит слабый гликолиз (медленное накопление молочной кислоты), или он отсутствует совсем.

     В состав заквасок вводят штаммы, которые не лизируются ни одним штаммом или лизируются немногими штаммами бактериофагов. Для предотвращения развития бактериофага применяют многоштаммовые закваски. При этом, если в закваске появляется фаг, он лизирует один-два штамма, остальные продолжают развиваться, обеспечивая кисломолочный процесс. 

VI. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЗАКВАСОК В СПЕЦИАЛЬНЫХ ЛАБОРАТОРИЯХ 

     В специальных научно-производственных лабораториях выделяют штаммы молочнокислых  микроорганизмов, изучают их свойства, селекционируют, составляют и получают закваски, которые направляют на предприятия молочной промышленности, где вырабатывают производственные закваски.

     В цехах по производству заквасок готовят  сухой и жидкий бактериальные  концентраты, маточные закваски в виде сухих и жидких заквасок, а также получают натуральные и сухие кефирные грибки (зерна).

     Сухой бактериальный концентрат в нашей стране чаще вырабатывают трех видов: мезофильных молочнокислых стрептококков, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных молочнокислых палочек. Жидкий бактериальный концентрат готовят из мезофильных молочнокислых стрептококков.

     Процесс приготовления сухого бактериального концентрата включает следующие  основные этапы: выращивание заквасочных  микроорганизмов, бактофугирование полученной культуры, высушивание суспензии клеток, фасование бакконцентрата.

     Питательной средой для выращивания молочнокислых  бактерий является молочная сыворотка  с добавлением кукурузного экстракта (или аминокислотно-микроэлементно-витаминного  комплекса), буферных солей и стимуляторов роста. В качестве буферных солей используют цитрат натрия или ацетат натрия. Стимуляторами роста молочнокислых бактерий являются сульфат марганца, аскорбиновая кислота и др.

     Молочнокислые бактерии различаются по потребности  в стимуляторах роста, в связи с этим предложены различные питательные среды для выращивания мезофильных, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек.

     В табл. 27 представлены рецептуры питательных  сред (на 1000 дм³) для наращивания клеток молочнокислых бактерий различных видов.

     При приготовлении среды в сыворотке  устанавливают рН 4,5-4,6 (оптимальную  для выделения белков), нагревают  ее до 95 ?С и выдерживают 60 мин  для более полного выделения  белков. После этого сыворотку  осветляют путем сепарирования.

     В осветленную сыворотку добавляют компоненты среды согласно рецептуре, устанавливают оптимальную рН, стерилизуют при 0,05 МПа (112 ?С) в течение 60 мин и охлаждают до температуры, оптимальной для роста микроорганизмов.

     Стерилизация  и охлаждение питательной среды, а также наращивание клеток молочнокислых бактерий осуществляются в ферментере, имеющем мешалку, в котором автоматически регулируются температура и рН на заданном уровне.

     В подготовленную стерильную среду, охлажденную  до оптимальной температуры развития того или иного вида молочнокислых бактерий, подают закваску в количестве 5-8 % (на сывороточной среде) или 3-5 % (на обезжиренном молоке).

     Наращивание клеток мезофильных молочнокислых  стрептококков ведут в ферментере при температуре 30 ?С в течение 10-12 ч, термофильных молочнокислых стрептококков и ацидофильных палочек - при 40 °С на протяжении 8-9 ч при автоматическом поддерживании рН. При этом рН культуральной жидкости достигает для стрептококков 6,5-6,8, для ацидофильных палочек 5,7-6,0.

     После окончания выращивания культуру охлаждают до 3-8°С и направляют на бактофугирование для получения бактериальной массы.

     Отделение клеток от среды осуществляют в конце  логарифмической фазы роста, когда  в культуральной жидкости (в 1 см³) содержатся сотни миллионов - единицы миллиардов активных клеток. Бактериальную массу из культуральной жидкости выделяют на бактофуге. Для этой цели можно использовать центрифугу и молокоочиститель.

     Бактериальная масса после бактофугирования содержит сотни миллиардов клеток в 1 см³; выход бакмассы составляет 0,5-0,8 %. Полученную бактериальную массу смешивают с защитной средой в соотношении 1 : 2 - 1 : 4. В состав защитной среды для мезофильных молочнокислых стрептококков входят: обезжиренное молоко с содержанием 16 % сухих веществ - 30% и 70 % водного раствора, содержащего сахарозу (5%), желатозу (5%), цитрата натрия (5%), глутамата натрия (2%). В состав защитной среды для ацидофильной палочки вместо цитрата натрия вносят 5 % уксуснокислого натрия. Защитная среда для термофильного стрептококка включает 20 % обезжиренного молока и 80 % водного раствора, содержащего по 2,2 % сахарозы, желатозы, лимоннокислого натрия и 1,2 % глутамата натрия.

     Желатоза  представляет собой желатин после  стерилизации под давлением 0,15 МПа  в течение 2,5-3,0 ч. После стерилизации желатин теряет способность образовывать гель.

     Полученную  суспензию клеток молочнокислых  бактерий высушивают. Для этого ее разливают на лотки слоем 6-8 мм или  фасуют по 2 см³ во флаконы. Суспензию высушивают в установке для сублимационной сушки сначала при низкой отрицательной температуре —35-(-45)°С, досушивание — при положительной температуре (40-45 °С). Продолжительность сушки суспензии на лотках 6-12 ч, во флаконах