Азотфиксирующие микроорганизмы и их роль в природе и хозяйственной деятельности человека

     Использовать  азотобактерин рекомендуется только на почвах, содержащих фосфор и микроэлементы. Азотобактерин применяют для  бактеризации семян, рассады, компостов. При этом урожайность увеличивается  на 10-15%. Семена зерновых опудривают сухим  азотобактерином из расчета 100 млрд. клеток на 1 гектарную порцию семян. Картофель и корневую систему  рассады равномерно смачивают водной суспензией бактерий. Для получения  суспензии 1 гектарную норму (300 млрд. клеток) разводят в 15 литрах воды. При  обработке почвенным или торфяным азотобактерином семена перемешивают с увлажненным препаратом и для  равномерного высева подсушивают. Корневую систему рассады смачивают приготовленной суспензией. [2] 
 
 
 

     Технология  получения препаратов клубеньковых бактерий 

     Отечественная промышленность выпускает два вида препаратов клубеньковых бактерий: нитрагин и ризоторфин. Оба препарата производятся на основе активных жизнеспособных клубеньковых бактерий из рода Rhizobium. Эти бактерии в симбиозе с бобовыми культурами способны фиксировать свободный азот атмосферы, превращая его в соединения, легкоусвояемые растением.

     Бактерии  рода Rhizobium - строгие аэробы. Среди  них различают активные, малоактивные и неактивные культуры. Критерием  активности клубеньковых бактерий служит их способность в симбиозе с бобовым  растением фиксировать атмосферный  азот и использовать его в виде соединений для корневого питания  растений.

     Фиксация  атмосферного азота возможна только в клубеньках, образующихся на корнях растений. Возникают они при инфицировании  корневой системы бактериями из рода Rhizobium. Заражение корневой системы  происходит через молодые корневые волоски. После внедрения бактерии прорастают внутри них до самого основания  в виде инфекционной нити. Выросшие нити проникают сквозь стенки эпидермиса в кору корня, разветвляются и  распределяются по клетками коры. При этом индуцируется деление клеток хозяина и разрастание тканей. В месте локализации бактерий на корне растения-хозяина образуются клубеньки, в которых бактерии быстро размножаются и располагаются по отдельности или группами в цитоплазме растительных клеток. Сами бактериальные клетки увеличиваются в несколько раз и меняют окраску. Если клубеньки имеют красноватую или розовую окраску, обусловленную наличием пигмента легоглобина (леггемоглобина) - аналог гемоглобина крови животных, то они способны фиксировать молекулярный азот. Неокрашенные ("пустые") или имеющие зеленоватую окраску клубеньки не фиксируют азот.

     Бактерии, находящиеся в клубеньках, синтезируют  ферментную систему с нитрогеназной  активностью, восстанавливающую молекулярный азот до аммиака. Ассимиляция аммиака  происходит, в основном, путем вовлечения его в ряд ферментативных превращений, приводящих к образованию глутамина  и глутаминовой кислоты, идущих в  дальнейшем на биосинтез белка.

     Помимо  критерия активности в характеристике клубеньковых бактерий используют критерий вирулентности. Он характеризует способность  микроорганизма вступать в симбиоз  с бобовым растением, то есть проникать  через корневые волоски внутрь корня  и вызывать образование клубеньков. Большое значение имеет скорость такого проникновения. В симбиотическом комплексе растение - Rhizobium бактерии обеспечиваются питательными веществами, а сами снабжают растение азотистым  питанием. С вирулентностью связана  и видовая избирательность, которая  характеризует способность данного  вида бактерий к симбиозу с определенным видом бобового растения. Классификация  различных видов Rhizobium учитывает  растение-хозяина, например: Rhizobium phaseoli - для фасоли, Rhizobium lupini - для люпина, сараделлы и т.д. Вирулентность  и видоспецифичность взаимосвязаны и не являются постоянными свойствами штамма.

     Задачей производства бактериальных удобрения  является максимальное накопление жизнеспособных клеток, сохранение их жизнеспособности на всех стадиях технологического процесса, приготовление на их основе готовых  форм препарата с сохранением  активности в течение гарантийного срока хранения.

     Отечественная промышленность выпускает два вида нитрагина: почвенный и сухой. Впервые  культура клубеньковых бактерий на почвенном  субстрате была приготовлена в 1911 году на бактериально-агрономической станции  в Москве. В настоящее время  его производство имеет ограниченное значение, так как технология довольно сложна и трудоёмка при выполнении отдельных операций. Более перспективна технология производства сухого нитрагина.

     Сухой нитрагин - порошок светло-серого цвета, содержащий в 1 г не менее 9 млрд. жизнеспособных бактерий в смеси с наполнителем. Влажность не превышает 5-7%. Промышленное производство имеет типичную схему. Необходимо отметить, что важно подбирать  штаммы, устойчивые к высушиванию. Для  производства посевного материала  исходную культуру клубеньковых бактерий выращивают на агаризованной среде, содержащей отвар бобовых семян, 2% агара и 1% сахарозы, затем культуру размножают в колбах на жидкой питательной  среде в течение 1-2 суток при 28-30^оС и рН 6.5-7.5. На всех этапах промышленного культивирования применяют питательную среду, включающую такие компоненты, как меласса, кукурузный экстракт, минеральные соли в виде сульфатов аммония и магния, мел, хлорид натрия и двузамещенный фосфат калия. Основная ферментация идет при тех же условиях в течение 2-3 суток. Готовую культуральную жидкость сепарируют, получается биомасса в виде пасты с влажностью 70-80%. Пасту смешивают с защитной средой, содержащей тиомочевину и мелассу (1:20) и направляют на высушивание. Сушат путем сублимации ( в вакуум-сушильных шкафах). Высушенную биомассу размалывают. Производительнее высушивание в распылительных сушках, но при этом 75% клеток теряют жизнеспособность. Препараты сухого нитрагина фасуют и герметизируют в полиэтиленовые пакеты по 0.2 - 1 кг, хранят при температуре 15^оС не более 6 месяцев. Семена опудривают перед посевом. Внесение нитрагина повышает урожайность в среднем на 15-25%.

     Препарат  клубеньковых бактерий может выпускаться  и в виде ризоторфина. Впервые  торфяной препарат клубеньковых бактерий был приготовлен в 30-х годах, но технология была создана в 1973-77 гг. Для  приготовления ризоторфина торф сушат при температуре не выше 100^оС и размалывают в порошок. Наиболее эффективным способом стерилизации является облучение его гамма-лучами. Перед стерилизацией размолотый, нейтрализованный мелом и увлажненный до 30-40% торф расфасовывают в полиэтиленовые пакеты. Затем его облучают и заражают клубеньковыми бактериями, используя шприц, с помощью которого впрыскивается питательная среда, содержащая клубеньковые бактерии. Прокол после внесения бактерий заклеивается липкой лентой. Каждый грамм ризоторфина должен содержать не менее 2.5 млрд. жизнеспособных клеток с высокой конкурентоспособностью и интенсивной азотфиксацией. Препарат хранят при температуре 5-6^оС и влажности воздуха 40-55%. Пакеты могут быть весом от 0.2 до 1.0 кг. Доза препарата составляет 200 г на га. Заражение семян производят следующем образом: ризоторфин разбавляют водой и процеживают через двойной слой марли. Полученной суспензией обрабатывают семена. Семена высевают в день обработки или на следующий.

     Обработка семян бобовых культур прочно вошла в мировую сельскохозяйственную практику. Крупнейшими производителями  таких препаратов являются США и  Австралия. [3] 

     Азотное питание 

     К числу аминоавтотрофов относятся  азотфиксирующие бактерии, свободно живущие в почве, и так называемые клубеньковые азотфиксирующие бактерии. Первый представитель азотфиксирующих  бактерий — Clostridium pasteurianum (анаэроб) —  был открыт в 1893 г. С. Н. Виноградским. В 1901 г. М. Бейеринк установил, что способностью усваивать атмосферный азот обладают также аэробные бактерии Azotobacter, занимающие по азотфиксирующей активности первое место (до 25 г азота на 1 кг использованного сахара), но менее распространенные в почве, чем С. pasteurianum. Азотфиксирующими свойствами обладают некоторые виды Pseudomonas, Bacillus, цианобактерий, а также пурпурные и зеленые серобактерии.

     Азотфиксирующие бактерии рода Rhizobium получили название клубеньковых потому, что они, размножаясь  на корнях ряда бобовых растений, образуют выросты-клубеньки. Размножаясь в  них, они превращаются из мелких палочек  в разветвленные формы — бактероиды, которые наиболее интенсивно связывают  молекулярный азот. Симбиоз клубеньковых бактерий с растениями взаимовыгоден, так как Rhizobium продуцируют ряд  физиологически активных соединений, которые благоприятно влияют на бобовые растения. После разрушения клубеньков клубеньковые бактерии живут в почве как сапрофиты.

     Азотфиксирующие бактерии восстанавливают азот с  помощью сложной ферментной системы  нитрогеназы, содержащей железо, молибден, магний. Эта система нуждается  в источнике электронов, которые  поступают через восстановитель с низким потенциалом, содержащий негеминовое железо — ферредоксин (переносчик электронов).

     Подробное выяснение механизма генетического  контроля азотфиксирующих систем бактерий может создать необходимые предпосылки  для искусственного переноса оперонов этих систем в геном растений и  конструирования трансгенных растительных организмов, обладающих азотфиксирующей  активностью, что имело бы огромное значение для сельского хозяйства.

     Вторая  большая группа аминоавтотрофов  представлена нитрифицирующими бактериями, которые используют для синтеза  белков в качестве основных источников азота соли аммиака, азотистой и  азотной кислот. Подсчитано, что  на образование вновь вырастающих  растений ежегодно требуется около 1,5 млрд тонн азота в форме, доступной растениям. Поэтому нельзя не отметить, что азотфиксирующим и нитрифицирующим бактериям принадлежит исключительно важная роль в обеспечении плодородия почвы.

     Аминогетеротрофы  для роста и размножения нуждаются  в различных органических азотистых  соединениях. Необходимо оговориться, что аминогетеротрофы представляют собой также неоднородную группу, так как многие из них нуждаются  для роста лишь в определенных аминокислотах, как, например, Francisella tularensis. Для ее роста требуется добавление к среде по крайней мере 10 аминокислот. В то же время многие бактерии, синтезируя аминокислоты и основания из минеральных источников азота, нуждаются в тех витаминах (ростовых факторах), которые сами не способны синтезировать: биотин (Н), тиамин (рибофлавин (В2), пантотеновая кислота (В3), холин (В4), никотинамид (В5), фолиевая кислота (В9) и ее производные.

     Наконец, есть патогенные бактерии, например группа гемоглобинофильных организмов (Haemophilus), которые для роста нуждаются в добавлении к питательной среде сложных веществ, содержащихся в крови: Х-факторов (гемин) и др. Кроме того, в результате различных мутаций аминогетеротрофные бактерии могут превращаться в мутанты, неспособные синтезировать тот или иной метаболит и поэтому нуждающиеся в нем. Такие мутанты получили название ауксотрофов. Они во многом способствовали изучению особенностей биохимии бактерий.

     Для нормальной жизнедеятельности бактерии, как и другие организмы, обязательно  нуждаются в ионах, а также  в фосфоре и сере, которые поступают  в клетку путем диффузии и активного  транспорта. Все процессы обмена веществ представляют собой цепь взаимосвязанных во времени и пространстве саморегулируемых реакций. Каждая из них и их совокупные пути катализируются соответствующими ферментами. [4] 

Механизм  биологической фиксации молекулярного азота 

  Как известно, атомы в молекуле азота (N2) соединены тремя ковалентными связями, энергия диссоциации которых  равна 9,4 • 105 дж/моль. Наибольшей энергией — 5,3-105 дж/моль — обладает первая связь, вторая — 2,5-105 дж/моль, третья — 1,6 • 105 дж/моль. Эти связи очень прочны, и молекулы азота поэтому химически инертны. Именно инертность азота обусловливает необходимость его активации, так же как и повышения химической активности вступающего с ним в реакцию соединения или элемента.

  Синтез  аммиака из атмосферного азота химическим путем, осуществляемый методом Габера — Боша, происходит при температуре 400— 500 °С и высоком давлении (200—1000 атм). Клетки микроорганизмов проводят процесс азотфиксации в обычных условиях.

  Каким образом фиксируют азот микроорганизмы, если и здесь сохраняется в  силе требование больших энергетических затрат для активации молекулы азота? Может быть, их энергетический обмен  дает такую возможность? В самом  деле, у азотфиксаторов, как указывает  В. Л. Кретович (1964), интенсивность энергии  обмена, в частности степень потребления  кислорода, значительно выше, чем  у бактерий, неспособных фиксировать  азот. И ферменты у них более  активные. Однако, каким путем эта энергия используется в процессе азотфиксации, до сих пор еще точно не установлено. В современных гипотетических схемах механизма азотфиксации несомненное предпочтение отдается восстановительному характеру превращений молекулярного азота, о чем в 20-е годы этого столетия утверждали наши замечательные соотечественники С. П. Костычев и С. Н. Виноградский, выдвигая «аммиачную теорию» фиксации атмосферного азота. У всех свободноживущих азотфиксирующих микроорганизмов, а также и при симбиотиче-ской азотфиксации аммиак (NHs) обнаружен в качестве первого стабильного продукта этого процесса.

  Наиболее  вероятно, что разрыв связей в молекуле азота происходит не сразу, а последовательно, в результате действия ферментных систем.

  В. Е.Шилов и Г.И.Лихтенштейн (1971) предложили интересный механизм активации азота  ферментом нитрогеназой (рисунок 7). Молекулярный азот через щель размером 4—5 А (это соответствует длине молекулы азота) поступает внутрь фермента и здесь активируется. В его активации большая роль принадлежит молибдену- и железосодержащим центрам, по цепям атомов которых происходит эстафетная передача активирующих азот электронов от восстановителя. Реакции активации способствует близость группировок серы.