Состав и свойства белков

Для изучения пространственной структуры белка, последовательности соединения аминокислот в том  или ином белке используют различные  физико-химические методы, из которых  наиболее эффективными оказались метод  ступенчатого расщепления и рентгеноструктурный  анализ.

Рентгеноструктурный анализ - метод исследования атомной  структуры в-ва с помощью дифракции  рентгеновских лучей. Рентгеновские  лучи взаимодействуют с электронными оболочками атомов. В результате этого  взаимодействия происходит дифракция  рентгеновских лучей и на фотопленке получается дифракционная картина  — пятна или окружности. Из дифракционной  картины при помощи сложных расчетов устанавливают распределение электронной  плотности в-ва, а по ней - род атомов и их расположение.

В настоящее время  установлено, что большинство белков состоят из 22 качественно разных а-аминокислот.

При образовании  молекулы белка или полипептида  а-аминокислоты могут соединяться  в различной последовательности. Возможно огромное число различных  комбинаций. Так же как, пользуясь 20...30 буквами алфавита, можно написать текст любой длины, так и из 20 а-аминокислот можно образовать больше 1018 комбинаций. Существование  различного типа полипептидов практически  неограничено.

Определение наличия  белка:

Для идентификации  белков и полипептидов используют специфические  реакции на белки. Например:

а) биуретовая реакция 

б) ксантопротеиновая  реакция (появление желтого окрашивания  при взаимодействии с онцентрированной азотной кислотой, которое в присутствии аммиака становится оранжевым; реакция связана с нитрованием остатков фенилаланина и тирозина);

в) реакция Миллона (образование желто-коричневого  окрашивания при взаимодействии с Hg(NО3)2+HNО3+HNO2

г) нингидриновая  реакция

д) при нагревании белков со щелочью в присутствии  солей свинца выпадает черный осадок PbS, что свидетельствует о присутствии  серусодержащих аминокислот.

е) сильное нагревание вызывает не только денатурацию белков, но и разложение их с выделением летучих продуктов, обладающих запахом  жженых перьев.

Белки обычно образуют коллоидные растворы. Многие реагенты вызывают осаждение белков — коагуляцию, которая может быть обратимой  и необратимой. Например, этанол и  ацетон коагулируют белки, но эта  коагуляция является обратимой. В чистой воде коагулированные этим способом белки снова образуют коллоидный раствор. Обратимую коагуляцию вызывают также растворы некоторых солей (MgSO4 (NH4)2SO4 Na2SO4). Необратимую коагуляцию (денатурацию) белка вызывает кипячение, а также действие минеральных  кислот, пикриновой кислоты, солей тяжелых  металлов, танина.

Синтез пептидов

Синтез пептидов связан с рядом существенных трудностей. Прежде всего, необходимы оптические активные изомеры а-аминокислот. Кроме того, требуются специальные приемы для  осуществления последовательного  образования пептидных связей в  нужной нам последовательности а-аминокислот: защита аминогрупп, активация карбоксильных  групп, отщепление защитных групп, множество  специальных реагентов.

Но грандиозная  работа по анализу и синтезу белков в последний период революционизировалась  благодаря использованию  высокоэффективных  автоматических приборов. К ним относят  синтезаторы — установки для  синтеза, круглосуточно работающие без человека по заданной программе. Это одно из проявлений компьютеризации  в химии. Создание таких автоматов стало возможным после появления новых плодотворных химических идей. Синтезаторы появились после предложения американским химиком P. Meрифилдом нового принципа — синтеза на полимерном носителе, обладающем определенными функциональными группами.

Такой способ исключает  необходимость выделения промежуточных  продуктов на каждой стадии синтеза  и легко подвергается автоматизации.

Изыскивая пути исусственного  получения белка, ученые интенсивно изучают механизм его синтеза  в организмах. Ведь здесь он совершается  в «мягких» условиях, удивительно  четко и с большой скоростью. (Молекула белка в клетке образуется всего за 2—3 с.) Выяснено, что синтез белков в организме осуществляется с участием других высокомолекулярных веществ—нуклеиновых кислот. В настоящее  время человек уже глубоко  познал механизм биосинтеза белка и  приступил к искусственному получению  важнейших белков на основе тех же принципов, которые столь совершенно отработаны в процессе развития органического  мира.

Кроме этого, промышленное получение белков осуществляется посредством  микробиологического синтеза. Оказалось, что, размножаясь на соответствующей  питательной среде, некоторые микроорганизмы могут создавать обильную белковую массу. На от ходах  гидролизного  производства спирта из древесины, например, выращивают кормовые дрожжи для животноводства. Использование продуктов микробиологического  синтеза в животноводстве позволяет  значительно повышать его продуктивность.

Искусственное получение  белка было актуальным вопросом уже  в прошлом столетии, когда стало  ясно, что белки построены из а-аминокислот  с помощью амидных (пептидных) связей. Первые синтезы низкомолекулярных  пептидов связаны с именем немецкого  химика Э. Фишера. В 1903—1907 гг. Э. Фишер  синтезировал полипептид, состоящий  из 19 остатков аминокислот. 
 
 
 
 

2. Ферменты.(Ф.)

ФЕРМЕНТЫ (от лат. fermentum - закваска) (энзимы), белки, выполняющие  роль катализаторов в живых организмах. Осн. ф-ции Ф.- ускорять превращение  в-в, поступающих в организм и  образующихся при метаболизме (для  обновления клеточных структур, для  обеспечения его энергией и др.), а также регулировать биохим. процессы (напр., реализацию ге-нетич. информации), в т. ч. в ответ на изменяющиеся условия.

 О механизме  р-ций с участием Ф. (ферментативных  р-циях) см. Ферментативный катализ  , Ферментативных реакций кинетика .

 Структуру Ф.  изучают методами хим. модификации,  рентгеновского структурного анализа,  спектроскопии. Ценные результаты  получены методом сайт-специфичного  мутагенеза, основанного на направленной  замене аминокислот в белковой  молекуле методами генетической  инженерии . К кон. 20 в. известно  и охарактеризовано ок. 3000 Ф.

Исторический очерк. Начало совр. науки о Ф. (энзимоло-гии) связывают с открытием в 1814 К. Кирхгофом превращения крахмала в сахар под действием водных вытяжек из проростков ячменя. Действующее  начало из этих вытяжек было выделено в 1833 А. Пайеном и Ж. Персо. Им оказался Ф. амилаза . В 1836 T. Шванн обнаружил  и описал пепсин , в том же году И. Пуркин и И. Паппенгейм охарактеризовали трипсин . В 1897 братья Г. и Э. Бухнеры  выделили из дрожжей р-римый препарат (т. наз. зимазу), вызывавший спиртовое  брожение. Этим был положен конец  спору Л. Пастера (он полагал, что  процесс брожения могут вызывать только целостные живые клетки) и  Ю. Либиха (считал, что брожение связано  с особыми в-вами). В кон. 19 в. Э. Фишер предложил первую теорию специфичности  Ф. В 1913 Л. Михаэлис сформулировал общую  теорию кинетики ферментативных р-ций. В кристаллич. виде первые Ф. были получены Дж. Самнером в 1926 (уреаза) и Дж. Нортропом  в 1930 (пепсин). Впервые первичная  структура (аминокислотная последовательность) Ф. была установлена У. Стейном и  С. Муром в 1960 для рибонуклеазы А, а в 1969 P. Меррифилдом осуществлен  хим. синтез этого Ф. Пространственное строение (третичная структура) Ф. впервые  установлено Д. Филлипсом в 1965 для  лизоцима. Во 2-й пол. 20 в. каталитич. активность была открыта также у  нек-рых РНК (их наз. рибозимы).

Классификация ферментов. Исторически многим Ф. присваивались  тривиальные названия, часто не связанные  с типом катализируемой р-ции. Для  преодоления возникших трудностей в сер. 20 в. были разработаны классификации  и номенклатура Ф. По рекомендации Международного биохим. союза, все Ф. в зависимости  от типа катализируемой р-ции делят  на 6 классов: 1-й - оксидоредуктазы , 2-й - трансферазы , 3-й - гидролазы , 4-й - лиазы , 5-й - изомеразы и 6-й - лигазы . Каждый класс делится на подклассы, в  соответствии с природой функц. групп  субстратов, подвергающихся хим. превращению. Подклассы, в свою очередь, делятся  на подпод-классы в зависимости от типа участвующего в превращении  Ф. Каждому достаточно охарактеризованному  Ф. присваивается классификационный  номер из 4 цифр, обозначающих класс, подкласс, подподкласс и номер  самого Ф. Напр., a-химотрипсин имеет  номер 3.4.21.1.

 К оксидоредуктазам  относятся F., катализирующие окислит.-восстановит.  р-ции. Ф. этого типа переносят  атомы H или электроны. Многие  оксидоредуктазы являются Ф. дыхания  и окислительного фосфорилирования. Трансферазы катализируют перенос функц. групп (CH3, COOH, NH2, CHO и др.) от одной молекулы к другой.

Гидролазы катализируют гидролитич. расщепление связей (пептидной, гликозидной, эфирной, фосфодиэфирной и др·)·

 Л и а з  ы катализируют негидролитич. отщепление  групп от субстрата с образованием  двойной связи и обратные р-ции.  Эти Ф. могут отщеплять CO2, H2O, NH3 и др.

 Изомеразы катализируют  образование изомеров субстрата,  в т. ч. цис- , транс -изомеризацию, перемещение кратных связей, а  также групп атомов внутри  молекулы.

 Л и г а  з ы - Ф., катализирующие присоединение  двух молекул с образованием  новых связей (С — С, С —  S, С — О, С — N и др.), как  правило, сопряженное с расщеплением  пирофос-фатной связи, напр. у  АТФ.

Особенности строения ферментов. Мол. масса Ф. составляет от 104 до 1010 и более. Чаще всего встречаются  Ф. с мол. м. 20-60 тыс., более крупные  обычно состоят из неск. одинаковых (гомомеры) или разных (гетеромеры) субьеди-ниц, связанных между собой нековалентными связями.

Субъединица может  состоять из двух и более цепей, соединенных  дисульфидными связями.

 В первичной  структуре однотипных Ф., выделенных  даже из эволюционно отдаленных  организмов, часто наблюдается определенная  гомология, а нек-рые участки  практически остаются неизменными.  Вторичная структура отличается  большим разнообразием по содержанию -спиралей и  -структур (см. Белки  ). -Структуры составляют ядро  многих Ф., образуя "опорную"  структуру. Совокупность стандартных  элементов вторичных структур  и специфически уложенных участков  полипептидной цепи, определенным  образом расположенных в пространстве, образует третичную структуру, определяющую биол. св-ва Ф.

 Третичная структура  уникальна для каждого Ф., однако  у однотипных Ф., даже сильно  отличающихся по первичной структуре,  пространственное расположение  цепей м. б. сходным (напр., химотрипсины  и субтилизины). Часто в третичной  структуре можно выделить отдельные  компактные части (домены), соединенные  участками полипептидной цепи. Организация  в пространстве неск. субъединиц  определяет четвертичную структуру  Ф.

 На пов-сти  белковой глобулы Ф. или, чаще, в спец. щели, углублении и т.  п. выделяют относительно небольшой  участок, наз. активным центром.  Он представляет собой совокупность  функц. групп аминокислотных остатков, непосредственно взаимодействующих  с субстратом. В активный центр  Ф., кроме функц. групп, могут  входить небелковые составляющие - коферменты . Такой комплекс наз.  х о л о -ферментом, а его  белковую часть - апоферментом. Аминокислотные  остатки, входящие в активный  центр, относятся к наиб. консервативным  в данной группе Ф. В активном  центре можно выделить субстрат-связывающий  участок и собственно каталитически  активные группы Ф. К последним,  напр., в подподклассе сериновых  протеаз относятся функц. группы  остатков серина-195, гистидина-57 и  аспарагиновой к-ты-102. Кроме того, в качестве каталитически активных  групп Ф. выступают группа SH цистеина, группа COOH глугаминовой к-ты, фенольный  гидроксил тирозина и др., а  также функц. группы коферментов  - никотинамидное кольцо никотинамидных  коферментов (см. Ниацин ), альдегидная  группа (в виде альдимина) пиридоксальфосфата, тиазолино-вое кольцо тиаминпирофосфата,  ионы металлов (напр., Zn2+, Co2+, Mn2+) и  др.

Получение ферментов. Обычно Ф. вьщеляют из тканей животных, растений, клеток и культуральных  жидкостей микроорганизмов, биол. жидкостей (кровь, лимфа и др.). Для получения  нек-рых труднодоступных Ф. используются методы генетической инженерии. Из исходных материалов Ф. экстрагируют солевыми р-рами. Затем их разделяют на фракции, осаждая  солями [обычно (NH4)2SO4] или, реже, орг. р-рителями, и очищают методами гель-проникающей  и ионо-обменной хроматографии. На заключит. этапах очистки часто используют методы аффинной хроматографии. Контроль за ходом очистки Ф. и характеристику чистых препаратов осуществляют, измеряя  каталитич. активность Ф. с применением  специфических (обычно дающих цветные  р-ции) субстратов. За единицу кол-ва Ф. принимают такое его кол-во, к-рое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 мин в стандартных  условиях. Число единиц Ф., отнесенное к 1 мг белка, наз. удельной активностью.

Применение ферментов. В неочищенном состоянии Ф. с  древнейших времен используют для получения  продуктов питания и выделки  изделий в хлебопечении, сыроделии, виноделии, обработке кож и т. д. Достаточно очищенные Ф. применяют  в произ-ве аминокислот и их смесей для искусственного питания, в произ-ве сахарных сиропов из углеводсо-держащего  сырья, для удаления лактозы из молока и в произ-ве ряда лек. ср-в (нек-рые  очищенные Ф. сами используются как  лек. ср-ва). Особенно перспективно применение в пром-сти иммобилизованных ферментов на полимерных носителях.