Вплив pН середовища на ферментативну активність

Міністерство освіти і  науки, молоді та спорту України

Національний університет харчових технологій

 

 

Кафедра біохімії і екології

 

 

 

 

Науково-дослідна робота на тему:

 

«ВПЛИВ PН СЕРЕДОВИЩА НА ФЕРМЕНТАТИВНУ АКТИВНІСТЬ»

 

 

 

 

Виконав:

студент гр. ХКВ – 2 – 2

Кириченко П.О.

 

Викладач:

доц. Зарицька М.В.

 

 

 

 

 

Київ 2011

 

План роботи

1. Загальні поняття про  ферменти. Їх класифікація та  властивості

2. Загальні поняття про полісахариди

3. Дія ферментів у біосинтезі крохмалю

4. Амілаза. Дія амілази  у переробці крохмалю

5. Вплив рН на активність ферментів

6. Методика проведення досліду

7. Розрахунок амілолітичної активності

8. Графік залежності активності ферменту від рН

9. Висновок

10. Література

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Загальні поняття  про ферменти. Їх класифікація  та властивості

Ферменти (від лат. fermentum –  закваска) – біологічні каталізатори білкової природи, які здатні збільшувати швидкість хімічних реакцій, але при цьому не входити до складу кінцевих продуктів реакції. Термін був запропонований на поч. XVII ст. голандським вченим Ван Гельмонтом.

Ферменти – основа обміну речовин у живій клітині. Велика кількість реакцій, які протікають у мікроорганізмах, рослинах та тваринах каталізуються ферментами. Каталіз  проходить у специфічній області  фермента, яку називають каталітичним центром. Активний центр складається  із залишків амінокислот, які приймають участь у зв*язуванні субстрата, а в каталітичний центр входять лише ті залишки АК, які приймають участь у безпосередньому процесі каталізу.

Особливістю ферментів є  специфічність їх дії на субстрат. Тобто, кожен фермент діє тільки на свій субстрат (чи групу схожих субстратів), в той час, як неорганічні каталізатори прискорюють багато відмінних між  собою реакцій. Специфічність дії  ферментів дозволяє уникати утворення  побічних продуктів реакції в  ході ферментативного процесу, що збільшує його ефективність.

Через білкове походження ферментів, їх каталітична активність дуже чутлива до змін фізико-хімічних властивостей середовища, які можуть впливати на структурну організацію  молекул ферментів, спричиняючи  їх денатурацію. Також активність ферментів  може суттєво змінюватись під  впливом хімічних сполук, що збільшують (активатори) чи зменшують (інгібітори) швидкість реакції, яка каталізується.

Класифікація та номенклатура ферментів

Спершу ферментам дали назви, які створювались шляхом додавання закінчення -аза до назви субстрату, на який діє фермент. Таким чином, ферменти, які гідролізують амілон (крохмаль) були названі амілазами, ферменти, які гідролізували ліпіди (жири) – ліпазами тощо. Пізніше ферментам, які каталізують схожі реакції почали давати назви, які характеризують тип даної реакції – дегідрогенази, оксидази, декарбоксилази тощо. Багато з цих назв використовуються і зараз.

Номенклатура, прийнята Міжнародним  біохімічним союзом (IUB), є доволі складною, але однозначною. Головним її принципом є те, що ферменти називають  та класифікують згідно з типом каталізуємої реакції та її механізмом. Основні  умови даної номенклатури:

1. Реакції та ферменти, які їх каталізують, розділяють на 6 класів.

2. Назва фермента складається  з двух частин, перша з яких  є назвою субстрату, а друга  – тип каталізуємої реакції.

3. Додаткова інформація, якщо вона необхідна, береться  в дужки. Наприклад, фермент,  який каталізує реакцію L-малат  + NAD’ = Піруват + СО₂+NADH+H⁺, має номер 1.1.1.37 та називається L-малат: NAD⁺ оксидоредуктаза (декарбооксилююча).

4. Кожен фермент має  кодовий номер по класифікації  ферментів (КФ): 1ша цифра вказує  на клас реакції, 2га – підклас,  а третя – підпідклас. 4та цифра  характеризує порядковий номер  фермента в його підпідкласі  .

Класифікація  згідно з типом реакції

1й клас. Оксидоредуктази – ферменти, що каталізують окисно-відновлювальні реакції різних типів.

До оксидоредуктаз належать дегідрогенази, оксидази, оксигенази, цитохроми тощо.

2й клас. Трансферази – ферменти, що каталізують реакції міжмолекулярного переносу хімічних груп.

Трансферази поділяють на аміно-, метил-, ацил-, фосфо-, глікозилтрансферази.

3й клас. Гідролази – ферменти, що каталізують реакції гідролізу, тобто розщеплення субстратів за участю молекули води.

4й клас. Ліази – ферменти, що каталізують реакції розщеплення ковалентних зв*язків між атомами C, O, S, N негідролітичним шляхом.

До ліаз належать декарбооксилази – ферменти, що відщеплюють від органічних кислот карбоксильну групу у вигляді СО₂, альдолази, що розщеплюють вуглець-вуглецеві зв*язки з утворенням альдегідів, дегідратази, які відщеплюють від субстратів молекулу води з утворенням подвійного зв*язку.

5й клас. Ізомерази – ферменти, що каталізують реакції ізомермзації субстратів.

6й клас. Лігази – ферменти, що каталізують реакції синтезу біомолекул, тобто утворення нових хімічних зв*язків за рахунок енергії АТФ.

Двокомпонентні  ферменти

Багато ферментів каталізують  реакцію лише в присутності специфічного термостабільної низькомолекулярної сполуки – кофермента. Його можна  розглядати як другий субстрат (косубстрат), тому що він набуває хімічних змін, які протилежні до тих змін, які  набуває субстрат. Холофермент (каталітично  активний комплекс) складається з  апофермента (білкова частина) та пов*язаного  з ним кофермента. Кофермент може бути зв*язаний з апоферментом ковалентними або нековалентними зв*язками. Визначення «простетична група» відноситься до ковалентно зв*язаного кофермента. До реакцій, які вимагають присутність коферментів, відносяться окисно-відновні реакції, реакції переносу груп, реакції конденсації та ізомеризації.

Іони металів, які входять  до складу ферментів, грають роль координаційних центрів комплекса, у якому з  металом пов*язані й апофермент, й субстрат. Внаслідок утворення  такого комплекса субстрат більш  тісно поєднується з апоферментом, що полегшує каталітичну дію. У деяких ферментах іони металів виконують  іншу функцію. Наприклад, в амілазах бактерій, тварин та рослин є від 1 до 4 атомів Са на 1 молекулу фермента. Са стабілізує амілази від кислотної та термічної  денатурації, захищає від впливу протеаз (ферментів, які гідролізують білки), грає важливу роль у створенні третинної структури білка.

Механізм ферментативного  каталізу

 

На даному рисунку ми наглядно спостерігаємо механізм розщеплення  α-1,4-глікозидних зв*язків у молекулі крохмалю під дією амілаз.

В активному центрі цих  ферментів знаходиться негативно  заряджена карбоксильна група та позитивно заряджена імідазольна  група, які утворюють потужну  нуклофільно-електрофільну систему  – карбоксилат-імідазолій.

Атом кисню володіє  більшим негативним індукційним  ефектом, ніж атом вуглецю. У зв*язку з цим атом кисню α-1,4-глікозидного зв*язку буде мати більшу густину електронної хмари, ніж атом С-1. Зниження густини хмари атома С-1 поєднано з індукційним впливом атома кисню глікозидного кільця. Це і є причиною електрофільно-нуклеофільного розриву зв*язку С₁-О у молекулі крохмалю карбоксилат-імідазольною системою. Штрихові лінії зображують з*єднання фермента із субстратом, яке призводить до перерозподілу електронів у комплексі та до зникнення перекривання електронних орбіт між С₁ і О. Зниження енергії активації у даному випадку є наслідком розриву зв*язку С₁-О.

 

 

 

 

2. Загальні поняття  про полісахариди

Полісахариди (глікани, поліоли) – високомолекулярні вуглеводи, які є продуктами конденсації  моносахаридів. Кількість моносахаридів, які входять до складу полісахариду може коливатися від кількох десятків до сотень тисяч; моносахариди зв*язані  між собою глікозидними зв*язками. Полісахариди поділяються на гомо- та гетерополісахариди, в залежності від того, як побудовані їх молекули: із залишків МС одного виду або залишків різних МС.

Полісахариди не мають  чітко окресленої кристалічної форми, не розчиняються у воді, не наділені відновлюючими здатностями. Під  дією кислот полісахариди гідролізуються до моносахаридів. Основою в побудові полісахаридів є молекула D-глюкози. Згідно з біологічною роллю полісахариди діляться на резервні та структурні. Більшість  резервних полісахаридів є дуже важливими компонентами харчових продуктів, виконуючи в організмі людини функцію джерела вуглеводів та енергії. Структурні полісахариди у клітинних стінках утворюють ланцюги, які перетворюються у волокна чи пластини та слугують, так званим, каркасом у живому організмі.

Крохмаль. Його властивості  та склад

Крохмаль – головний резервний  полісахарид рослин, міститься у  картоплі (20%), кукурудзі (55-60%), рисі (80%), крупах (70-80%).

Крохмаль наділений гідрофільними  властивостями. Але у холодній воді зерна крохмалю лише набухають, однак  не розчиняються. Процес набухання  має ендотермічний характер. Якщо водяну суспензію нагрівати, то швидкість  набухання зросте. Під дією теплової енергії руйнується структура крохмальних зерен, вони збільшуються у розмірах, руйнуються і суспензія переходить ц крохмальний клейстер. Ці властивості крохмалю виконують важливу роль у переробці крохмаловмісної сировини у хврчовому виробництві. Наприклад, у технології хлібопекарства формування м*якоті хліба пов*язане з утворенням гелю. Від процесу старіння цього гелю залежить черствіння хліба.

Характерною властивістю  крохмалю як індикатора є його здатність  забарвлюватись йодом у темно-синій  колір.

Полісахаридна фракція крохмалю складається з амілози та амілопектину.

 

Амілоза легко розчиняється у теплій воді та дає нестійкі розчини  з порівняно низькою в*язкістю. Тривале зберігання розчину призводить до випадання амілози в осад; цей процес має назву ретроградації амілози. При дії йодом на розчин він забарвлюється у синій колір.

Амілопектин розчиняється у  воді при кип*ятінні, особливо інтенсивно цей процес проходить при температурі  близько 120 ^оС.Розчини амілопектину є стійкими при зберіганні, при додаванні до них йоду забарвлюються у червоно-фіолетовий колір.

Молекула амілози має  лінійну структуру, є довгим ланцюгом із залишків α-D-глюкопіранози, з*єднаних  між собою α-1,4-глікозидними зв*язками. Один з кінцевих залишків глюкопіранози  є редукуючим.

Амілопектин має дуже розгалужену  структуру, його молекулу складає близько 50 тис. залишків α-D-глюкопіранози. Поруч з α-1,4-глікозидними він має також α-1,6-глікозидні зв*язки.

До складу крохмалю входить  близько 70-90% амілопектину, решта 10-30% складає  амілоза.

Рентгенографічні дослідження  показали, що крохмальні зерна мають  мікрокристалічну структуру, хоча візуально  – це білий аморфний порошок. В  деяких умовах кристалічні частини  руйнуються, переводячи зерна в цілком аморфний стан. Мінеральні кислоти  при кімнатній температурі швидко руйнують аморфну частину крохмалю, і залишаються чітко виражені кристали.

Густина сухого крохмалю доволі висока і дорівнює 1,5. Це використовується при його виділенні на крохмале-патокових  заводах методами седиментації та центрифугування.

 

 

 

 

 

 

 

3. Дія ферментів у біосинтезі крохмалю

Як було зазначено вище, крохмаль є запасним полісахаридом. У процесі фотосинтеза він відкладається у хлоропластах, перетворюється там у сахарозу, та переходить у корні та семена рослин. Крохмаль запасається у вигляді крохмальних зерен в нефотоситезуючих клітинних органелах – амілопластах.

Синтез компонентів крохмалю починається з амілози, згодом її частина перебудовується для  синтезу більш складного компонента – амілопектину. Утворення амілози  здійснюється під дією фермента крохмалсинтази, який каталізує перенесення α-D-глюкози від ADP-D-глюкози до невідновлюючого кінця α-1,4-глюкана.

Встановлено, що в синтезі  амілози приймає участь 2 крохмалсинтази. Одна з них, яка тісно пов*язана  з крохмальними зернами, може використовувати  в якості донора глюкози як UDP-D-глюкозу, так і ADP-D-глюкозу, незважаючи на пріорітетність останнього поєднання. Другий фермент є розчинним, знаходиться у хлоропластах фотосинтезуючої системи, вона специфічна тільки до ADP-D-глюкози.

Але крохмалсинтаза не здатна каталізувати утворення α-1,6-глікозидних  зв*язків, тому існує спеціальний  «розгалужуючий» фермент, званий також Q-ферментом – глікозил-(1,6)-трансфераза.

 

Q-фермент перетворює амілозу в амілопектин, каталізуючи перенесення α-1,4-фрагменту, який складається з 15-20 глюкозних залишків, з нередукуючого кінця ланцюга амілози. Відновлююча група даного фрагменту створює α-1,6-глікозидний зв*язок з тим же чи іншим ланцюгом амілози.

Поглиблені перетворення крохмалю здійснюються при проростанні  семен та клубнів. При цьому різко  зростає активність α- та β-амілаз, які  гідролізують крохмаль з утворенням декстринів та мальтози, проходить  накопичення сахарози внаслідок  реакцій трансглікозилування.