Взаимодействие ассоциативных ризобактерий (Klebsiella planticola) и растений (на примере огурца) в условиях стрессовых факторов

МИНИСТЕРСТВО  СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА  РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ  российский государственный аграрный университет – МСха имени К.А. Тимирязева

 

Факультет почвоведения, агрохимии и экологии

Кафедра экологии 
 
 

ОТЧЕТ 

по преддипломной практике

               на  тему: Взаимодействие ассоциативных ризобактерий (Klebsiella planticola)  и растений (на примере огурца) в условиях стрессовых факторов 
 
 

Руководитель  от кафедры 

Доцент каф. экологии 

Раскатов В.А.                                              

Руководитель  от лаборатории

Доцент каф. микробиологии 

Селицкая О.В.

          

Исполнитель

Студентка 505 группы

Васкина М.Ю.         
 

Москва 2011 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение

      Актуальность  проблемы. В настоящее время в связи с возрастающим антропогенным воздействием на почву и ухудшением, в связи с этим, экологической ситуации большое значение приобрела разработка биотехнологических методов оптимизации роста сельскохозяйственных растений, в том числе разработка и внедрение высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, использование которых является экологически безопасным.[4] Открытие явления ассоциативной азотфиксации обосновало целесообразность искусственного обогащения ризосферы небобовых растений отобранными штаммами бактерий, способных к комплексному положительному воздействию на растения, в том числе к активному связыванию молекулярного азота. Последнее особенно важно для овощных культур, нуждающихся в больших дозах азота в доступной форме.[7] Однако более поздние исследования показали, что микроорганизмы, находящиеся в ассоциативном симбиозе с растением, способны комплексно воздействовать на него, поставляя растению различные фитогормоны и витамины и получая от него, в свою очередь, питательные вещества. По результатам опытов в защищённом грунте некоторые ассоциативные азотфиксаторы способны более чем на 50% заменить минеральный азот, вносимый под овощные культуры, а также снизить потребность в фосфорных и калийных удобрениях, в фунгицидах. Имеются данные о достоверных прибавках урожая на ряде зерновых и овощных культур в диапазоне 20-76%.[7] Однако широкое применение микробных землеудобрительных препаратов в практике сельского хозяйства сдерживается нестабильностью положительного эффекта во времени. Многие исследователи связывают это явление с неблагоприятными природно-климатическими условиями. Процент доступной влаги и температура являются одними из лимитирующих факторов развития как микроорганизмов, так и растений. Также низкая эффективность инокуляции часто обусловлена особенностями взаимодействия микробных популяций в почве: слабая конкурентоспособность интродуцентов, а также способность образовывать ассоциации  с вредной для растений микрофлорой или ингибировать активность полезных форм микроорганизмов может оказать влияние на эффективность инокуляции и искажать ожидаемую реакцию растений на интродукцию ассоциативных бактерий.[4]

      Цель  работы: изучение влияния стрессовых факторов на взаимодействие растений огурца и ассоциативных ризобактерий Klebsiella Planticola в условиях ассоциативного симбиоза.

      Задачи исследования:

1. изучить влияние данных микроорганизмов на рост, развитие и физиологические особенности растений огурца в условиях водного стресса;
2. исследовать влияния стрессовых факторов на микроорганизмы;
3. определить условия применения биопрепаратов на основе исследованных в работе ассоциативных бактерий для повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям внешней среды.

1 Обзор литературы

1.1 Взаимодействие микроорганизмов и растений

1.1.1 Микроорганизмы зоны корня и их влияние на растения

      На  поверхность корней и надземных  частей растений выделяются органические соединения, синтезированные растительным организмом. Это явление называют экзосмосом. В зависимости от многих причин интенсивность экзосмоса может быть большей или меньшей. Количество соединений, выделяемых растениями в течение жизни, может составлять до 10% растительной массы и более.[1]

      При корневом экзосмосе образуются различные органические кислоты — яблочная, янтарная, винная, лимонная, щавелевая и др. Обнаружены и сахара, представленные альдозами и кетозами, а также некоторые аминокислоты (аланин, лизин и др.). Состав продуктов экзосмоса отдельных растений в той или иной степени различается.

      В выделениях корней присутствуют физиологически активные соединения — витамины, ростовые вещества, иногда алкалоиды и т. д. Многие из них в некоторых количествах  выделяются и надземными органами растений. Поэтому на корнях и надземных органах растений обильно размножаются сапротрофные микроорганизмы. Подобное явление обусловливает образование биологических сообществ, основанных на взаимодействии растений с широким спектром почвенных микроорганизмов, которые поселяются на поверхности корней или проникают в растительные ткани. Получая от растений доступное органическое вещество (корневые выделения некоторых растений составляют до 30% синтезируемой ими биомассы), почвенные микроорганизмы поставляют своим партнерам легкоусвояемые соединения азота и фосфора, синтезируют стимулирующие развитие растений фитогормоны и витамины, снижают численность и подавляют активность почвенных фитопатогенов.[1]

      В составе микрофлоры зоны корня обычно выделяют «корневые» микроорганизмы, поселяющиеся на самой поверхности корня, — микроорганизмы ризопланы. Отдельно рассматривают группу микробов, обитающих в слое почвы, прилегающем к корню, микроорганизмы ризосферы. Количество микроорганизмов на поверхности корня и в ризосфере в сотни раз больше, чем в остальной массе почвы. В зоне молодого корня в основном размножаются неспорообразующие бактерии. Здесь же встречаются микроскопические грибы, дрожжи, водоросли и другие микроорганизмы.

      Способность специфичных групп микроорганизмов  развиваться в ризосфере определенных видов растений и оказывать положительное или негативное воздействие определила необходимость чередования культур, т. е. севооборота. Не рекомендуется возделывать друг за другом сельскохозяйственные растения, имеющие общих вредителей и болезни.[1]

1.1.2 Ассоциативная азотфиксация

      В 1974—1976 гг. бразильский ученый И. Доберейнер впервые обнаружила спиралевидные грамотрицательные аэробные (микроаэро-фильные) бактерии — азоспириллы, развивающиеся в ризосфере и ризоплане тропических травянистых растений, обладающие способностью к азотфиксации и вступающие в ассоциативные взаимоотношения с растениями.[1]

      Рост  и развитие ассоциативных бактерий связаны с поступлением к ним от растений легкодоступных источников углерода и энергии в виде корневых выделений (сахаров, органических кислот и других органических веществ), а также корневого отпада и опада.

      Ассоциативная азотфиксация протекает практически  во всех почвах в прикорневом пространстве или на корнях различных небобовых растений. Достаточно высокий уровень азотфиксации обнаружен в ризосфере тропических растений — сорго, кукурузы, сахарного тростника, паспалум и др. В почвах зоны умеренного климата азотфиксация выявлена в ризосфере разнообразных небобовых растений — зерновых, корне- и клубнеплодных, овощных культур, пастбищных и дикорастущих злаков, растений влажных и суходольных лугов, лесных трав.[1]

      Активность  ассоциативной азотфиксации определяется количеством органических веществ — корневых выделений и корневого спада, поступающих в прикорневую зону небобовых растений.[1]

1.1.3 Характеристика ризобактерии Klebsiella planticola

            Klebsiella planticola штамм  ТСХА-91 AmpR. Бактерия рода Klebsiella относится  к семейству Enterobacteriaceae, включающему  в себя ряд организмов, обитающих  в кишечнике человека и животных и вызывающих заболевания (например, Klebsiella pneumoniae). Данный вид относится к эндофитным ризобактериям, которые способны проникать в корневую систему растений и фиксировать азот атмосферы. По отношению к растениям это ассоциативный микроорганизм. Бактерии вида Klebsiella planticola – это факультативно-анаэробные грамотрицательные неспорообразующие прямые палочки длиной порядка 1,2 мкм, шириной около 1,1 мкм, высотой около 200 нм, неподвижные, в парах или в коротких цепочках.[7] Клетки имеют полисахаридную капсулу с фимбриями. Капсульный материал формирует толстые тяжи фиброидных структур, массивно покрывающих поверхность бактерий. Капсула выполняет защитную функцию, обладая анти-фаголитической активностью. При размножении капсула не разделяется, поэтому несколько клеток могут иметь общую капсулу.

      Колонии кремового цвета, слегка выпуклые, округлые, гладкие. Встречаются в воде, почве, на фруктах и овощах. Данный штамм  способен к фиксации молекулярного  азота воздуха. Был выделен в лаборатории микробиологии РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева с поверхности корней (ризопланы) огурцов (Емцев В. Т., 1995).

            Штамм Klebsiella planticola ТСХА-91 AmpR был выделен из ризосферы растений огурца в РГАУ-МСХА им. К. А. Тимирязева и испытан на этих растениях. Показано, что при оптимальных условиях выращивания данный штамм увеличивает урожайность пчёлоопыляемых сортов и гибридов растений огурца в среднем на 24%, снижает содержание нитратов и увеличивает количество семян в плодах, на 30-40% заменяет минеральный азот в почве. Установлено (Емцев В. Т. с соавт., 1991, 1995), что штамм Klebsiella planticola ТСХА-91 AmpR эффективно справляется с такими заболеваниями картофеля, как фитофтороз, ризоктониоз, парша. Также он подавляет рост некоторых представителей родов Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Mucor, Thelaviopsis.[3]

1.2 Влияние стрессовых факторов(дефицит влаги) на микроорганизмы и ассоциативный симбиоз

      Микроорганизмы, как и растения, усваивают питательные  вещества в основном из почвенного раствора за счёт более высокого осмотического давления, чем почвенный раствор. Осмотическое давление клетки у грамположительных бактерий достигает 30 ат., у грамотрицательных – 4-8 ат., поэтому большинство из них способны развиваться в почве при наличии хотя бы гигроскопичной влаги. В обычных почвах со средней влажностью осмотическое давление раствора колеблется в пределах 0,5 ат., в солончаках этот показатель может достигать 160 ат. В южных почвах микробы адаптированы к более сухим условиям существования, чем в северных.[10]

            Считается, что мобилизационные, агрономически желательные процессы лучше всего протекают при  влажности почвы в районе 60% полной влагоёмкости. При более сильном  увлажнении воздух из почвы вытесняется, что подавляет аэробные микробиологические процессы.

            При влажности почвы 60% от полной влагоёмкости лучше всего  проходят процессы аммонификации и  нитрификации. Оптимум фиксации азота  несколько сдвинут в сторону  более высокой влажности, так  как молекулярный азот связывают  многие бактерии, склонные к анаэробиозу.[5]

            Температурно-водный режим оказывает большое влияние  на формирование микробных сообществ  почвы. В ходе распада органического  вещества закономерно сменяются  микробные сообщества, а также  систематические группы микроорганизмов. В разных климатических зонах разложение органического вещества идёт с неодинаковой скоростью, что существенно сказывается на составе микрофлоры почвы[5].

      Согласно  Заварзину Г. А. (1974) влияние отдельных  факторов может в значительной степени  варьировать в различных участках одной и той же почвы, что обусловливает появление экологических микрониш, условия в которых определяют направление развития микроорганизмов. Только в исключительных случаях набор всех звеньев в микронише изменяется в зависимости от смены источников питания, от типов почв, обладающих различными потенциальными возможностями. При этом реакция одних и тех же микроорганизмов не всегда одинакова и зависит от динамики состава и активности всего микробиологического сообщества в почвенной среде.[6] Однако при всём этом всегда, в конце концов, в процессе сукцессии достигается динамическое равновесие, что является результатом взаимодействия среды и микрофлоры.

            Тот или иной фактор внешней среды может самым различным образом сказываться на ассоциативный симбиоз.

            Можно отметить, что  активность ассоциативной азотфиксации зависит от комплекса факторов, в  котором растение играет ведущую роль. Такие абиотические факторы среды, как почва и атмосфера, влияют как на растение, так и на микроорганизмы в ризосфере.[11]

      При изучении климатических факторов, влияющих на активность азотфиксации, было выявлено, что существует довольно чёткая тенденция: с повышением влажности почвы до 60-70% ПВ (полная влагоёмкость) азотфиксация возрастает до максимума, а низкая влажность почвы (30-40% ПВ) ингибирует фиксацию азота.  Известно, что влажность почвы является одним из важнейших условий активного функционирования азотфиксирующей микрофлоры. Согласно Садыкову Б. Ф. (1980) при оптимальной влажности создаются необходимые условия для интенсивного фотосинтеза и высокого уровня экскреции корневых выделений, что способствует поддержанию активного физиологического состояния и высокой численности ризосферных микроорганизмов.[11]  

 

2 Объекты и методы исследований

2.1 Объекты исследования

В качестве объектов исследований были взяты:

1. ассоциативные эндофитные ризобактерии Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 (до 200 мкг/л среды) из коллекции кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.
2. партенокарпический гибрид огурца (Сиситis sativus) сорта «Марьина Роща» агрофирмы «Манул»

2.2 Методы исследований

2.2.1 Методы проведения микробиологического опыта: