Взаимодействие ассоциативных ризобактерий (Klebsiella planticola) и растений (на примере огурца) в условиях стрессовых факторов

1. Техника посева микроорганизмов

      Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. При посеве клеток микроорганизмов  из пробирки в пробирку обе пробирки (одну — с культурой, другую — со стерильной питательной средой) берут в левую руку. Одну пробирку зажимают между указательным и средним пальцами (первая пробирка). Нижний конец ее свободно лежит на большом пальце (с его левой стороны). Вторую пробирку зажимают между средним и безымянным пальцами. Она должна лежать параллельно первой. Ее нижний конец располагается с правой стороны большого пальца. Большой палец, находясь между пробирками, должен быть в естественном, ненапряженном состоянии и слегка удерживать пробирки в параллельном по отношению друг к другу положении.

      При взятии мазка пробирки должны находиться в наклонном положении, гарантирующем  стерильность культуры. При вертикальном расположении пробирок возможно попадание  из воздуха посторонних клеток микроорганизмов.

      В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую иглу (петлю), держа  ее в правой руке в отвесном положении. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью. Пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и переносят во вторую пробирку.

      При высеве в плотную скошенную среду  иглой с культурой легким движением, не повреждая среды, проводят прямую или волнообразную черту по ее поверхности — посев штрихом.

      При посеве в столбик питательной среды иглу вводят в толщу ее центральной части — посев уколом. При посеве в жидкую среду (или из жидкой среды) лишь слегка наклоняют пробирки, чтобы избежать смачивания пробок и краев пробирок.

      Пробки, перед тем как ими закрыть  пробирки, обжигают в пламени. Удобнее сначала закрыть первую пробирку, а затем — вторую.[2]

2. Методика стерилизации

   Стерилизация, или обеспложивание, — это полное уничтожение клеток микроорганизмов  в питательных средах, посуде и  пр.

Известно  несколько методов:

1.Фламбирование,  или прокаливание

     Прокаливать можно непосредственно перед  употреблением платиновые петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, ланцеты, пинцеты), а также  стеклянные палочки, предметные, покровные  стекла и т. д.

2.Стерилизация  сухим жаром

     Ее  применяют для обработки посуды и сухих материалов, например крахмала, мела. При этом стерилизуемый объект выдерживают при 170 "С в течение 2 ч (считая с того момента, как установлена необходимая температура) в печи Пастера (рис. 8, а) или в электросушильных шкафах. Поднимать температуру выше 170 °С не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться (буреют, становятся ломкими).

     Перед стерилизацией стеклянную посуду закрывают  ватными пробками и обертывают бумагой. Чашки, пробирки, пипетки, вату, марлю  заворачивают в бумагу или помещают в особые футляры и пеналы, в которых стерильная посуда может храниться после стерилизации.

     По  окончании стерилизации шкаф открывают  только после того, как температура  снизится до комнатной, иначе стекло может лопнуть.

3.Стерилизация текучим паром

  Текучим паром (100 °С) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, молоко). Проводят стерилизацию в кипятильнике Коха (рис. 8, б) по 30 мин в течение 3 суток ежедневно. Такая стерилизация называется дробной.

     Кипятильник Коха — высокий металлический  цилиндр с двойным дном, свободно закрывающийся конусообразной крышкой  с отверстием для термометра. Снаружи  цилиндр покрыт асбестом или линолеумом. На дно кипятильника наливают воду, устанавливают подставку с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые предметы. Продолжительность стерилизации отсчитывают с момента интенсивного выхода пара из-под крышки и повышения температуры до 100 "С.

     При однократном прогреве при температуре 100 °С в течение 30 мин погибают вегетативные клетки, споры же многих микроорганизмов остаются жизнеспособными. После такого прогрева среду помещают на 24 ч в термостат при 28—30 °С. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают за это время прорасти в вегетативные формы, которые погибают при последующем нагревании. Затем эту операцию повторяют еще 2 раза.

4.Стерилизация  насыщенным паром  под давлением

     Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. С его  помощью стерилизуют большинство питательных сред, посуду. Обработку насыщенным паром проводят в герметически закрывающемся толстостенном котле — автоклаве. На массивной крышке или сбоку котла находятся кран для выхода пара, манометр и предохранительный клапан. Манометр показывает, на сколько давление пара внутри котла выше нормального. Для предотвращения взрыва при превышении предельного давления срабатывает предохранительный клапан, давая выход пару.

     Показателю  манометра в физических атмосферах соответствует определенная температура.

     Надежной   стерилизации   достигают   нагреванием   при 120 °С и давлении 1 атм в течение 20 мин.

     Стерилизацию  ведут следующим образом. Наливают воду в автоклав, помещают в него стерилизуемые предметы, завинчивают  крышку автоклава и начинают подогрев. Кран оставляют открытым до тех пор, пока весь воздух, находящийся в автоклаве, не будет вытеснен парами воды. Когда пар начнет выходить из крана непрерывной струей, кран закрывают, доводят давление пара в автоклаве до 1 атм и поддерживают на этом уровне 20—30 мин. Затем нагрев прекращают, ждут, пока стрелка манометра опустится до 0, осторожно (понемногу) открывают кран и спускают пар. Только потом отвинчивают крышку автоклава. Если кран открыть раньше, чем упадет давление, то жидкость в стерилизуемых сосудах закипит и вытолкнет из них пробки.

     Для контроля за работой автоклавов среди  стерилизуемых предметов можно  закладывать специальные тесты-ампулы, содержащие химические вещества, которые  плавятся при определенной температуре. Так, температура плавления бензонафтола 110 °С, антипирина — 113 °С.

     Автоклав  используют и для дробной стерилизации текучим паром. В этом случае крышку не завинчивают, чтобы обеспечить свободный  выход пару.

5.Пастеризация

     Пастеризация  представляет собой неполную, или  частичную, стерилизацию, что означает нагревание при 65—80 "С в течение соответственно 30—10 мин с последующим быстрым охлаждением до 10—11 °С. Прием был предложен Л. Пастером для уничтожения неспорообразующих бактерий в продуктах, чьи свойства ухудшаются при кипячении (молоко, пиво, вино и др.).

6. Холодная стерилизация-фильтрование через мелкопористые фильтры

     Применяют для обработки сред, компоненты которых  легко разлагаются при нагревании. Через мелкие поры фильтра могут  пройти только ультрамикроорганизмы (вирусы, бактериофаги).[2]

3. Методы учета численности микроорганизмов (КОЕ)

     В почве методом питательных пластин  в сочетании с методом последовательных разведений

     Почва — наиболее благоприятная среда  для развития микроорганизмов. В  связи с большой гетерогенностью  ее состава для учета численности в ней микроорганизмов с исследуемо/о участка берут среднюю почвенную пробу.

     Сначала готовят суспензии (методом разведения), содержащие разные концентрации почвы  в 1 мл воды. Для этого на стерильное часовое стекло стерильным фарфоровым шпателем или алюминиевой чайной ложкой берут из банки или мешка навеску почвы в 1 г. Часовое стекло, шпатель, ложку фламбируют в пламени горелки или, смочив в спирте, обжигают. При взвешивании почвы часовое стекло накрывают другим стерильным часовым стеклом.

     Навеску почвы, соблюдая условия асептики, переносят  в колбу на 250 мл с 99 мл стерильной воды. Смесь взбалтывают 5 мин, не смачивая пробку. Стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии, содержащей 10~2 г почвы, и  переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. Пипетку неоднократно промывают водой в пробирке, чтобы максимально смыть клетки с ее стенок. Другой стерильной пипеткой берут из колбы еще 1 мл суспензии и помещают во вторую колбу, также содержащую 99 мл стерильной водопроводной воды. Эту пипетку промывают таким же образом, как и в первом случае. Пробирку и вторую колбу взбалтывают 1 мин. Концентрация почвы в пробирке будет 10~3 г, во второй колбе — 10~4 г. Точно так же новыми стерильными пипетками переносят по 1 мл суспензии из второй колбы во вторую пробирку с 9 мл и в третью колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды и готовят новые суспензии, содержащие в 1 мл соответственно 10~5 и 10~6 г почвы.

     Для определения численности микроорганизмов  в каждом разведении методом питательных пластин можно провести глубинный или поверхностный посев. Последний более сложен и занимает больше времени. Поэтому для подсчета численности бактерий в почве методом питательных пластин можно ограничиться глубинным посевом, а поверхностный использовать при учете численности различных физиологических групп микроорганизмов на плотных средах.

     Для определения количества живых клеток, содержащихся в 1 мл суспензии каждого  разведения, берут по 1 мл этих суспензий  и переносят в стерильные чашки  Петри, используя всякий раз новую стерильную пипетку (лучше пипетку Мора). На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Затем в чашки Петри вливают расплавленный МПА, заранее приготовленный и разлитый в пробирки на 20 мл (2/3 объема) из расчета одна пробирка на чашку. Температура агара должна быть примерно 45С. Ее определяют, прикладывая пробирку с расплавленным агаром к щеке: если щеке не горячо — среду можно вылить в чашку Петри. Осторожными круговыми движениями чашки, не смачивая крышку, агар перемешивают с суспензией. Чашки с застывшим агаром переворачивают вверх дном, чтобы избежать попадания на его поверхность конденсационной влаги с крышки, и помещают в термостат при 28—30 "С.

     Клетки  микроорганизмов, попав в питательную  среду, начинают размножаться и образуют видимые невооруженным глазом колонии. Каждая колония на чашке с питательной средой вырастает из одной колониеобразующей единицы (КОЕ), которая может представлять собой бактериальную, дрожжевую клетку, спору, кусочек мицелия актиномицета или гриба. Через 48 ч инкубации чашки вынимают из термостата и предварительно подсчитывают число колоний. В связи с тем что существуют медленнорастущие формы бактерий, окончательный подсчет делают на 5-е сут.

     Количество  КОЕ в 1 г сырой почвы устанавливают, умножая число колоний в чашке на степень разведения — число, показывающее, во сколько раз в каждом конкретном случае разбавили 1 г почвы.[2]

2.2.2 Методы проведения  вегетационного опыта

      Семена  огурца выращивали в чашках Петри  при (25С и в течение 2 суток). Проросшие семена огурца высевали в вегетационные сосуды объёмом 7 литров, наполненные специальным торфяным питательным субстратом (ТПС) для выращивания овощных культур в закрытом грунте.[3]

     Повторность опыта пятикратная. Влажность исходного  субстрата в опыте составляла 60-67% ПВ, на протяжении опыта её поддерживали на уровне около 85-90% ПВ (нормальная влажность для огурца), около 45-50% ПВ - дефицит увлажнения для огурца. Состояния дефицита влаги добивались ограничением полива растений и контролировали дефицит путём определения влажности почвы, а также внешнего состояния растений. Статистическую обработку данных проводили путем дисперсионного анализа.[3]

     После появления первого настоящего листа  растения огурца инокулировали раствором  суточной культуры бактериальных препаратов (1 часть суточной культуры на 100 частей водопроводной воды). Аккуратно вносили под каждое растение 50 мл суспензии. Суточную культуру готовили, внося 1 петлю штамма в 100 мл соответствующей среды (среда К2 [Емцев и др., 1995] для бактерий Klebsiella planticola).

     Анализы проводили через 2, 5 и 7 недель, которые  включали в себя измерение следующих  показателей:

1) у  растений определяли: концентрацию  хлорофилла а и Ь в листьях  спектрофотометрическим методом;  интенсивность транспирации листьев весовым методом по Иванову; морфологические показатели (количество листьев и завязей, площадь листьев методом интерполяции фигур, высоту растений), продуктивность растений (урожайность) [Третьяков, 2003];

2) для  изучения микроорганизмов определяли: численность внесённых штаммов в ризоплане; общую численность азотфиксирующих микроорганизмов в ризоплане, эндосфере корней.