Санитарно – микробиологическое значение и методика выявления при ветеринарно – санитарной экспертизе пищевых продуктов микроорганизма

Допустимые микробиологические показатели продукта перед стерилизацией  сырья и других компонентов
Наименование  продукта перед стерилизацией	Споры Сlostridium botulinum
Мясо птицы в собственном  соку	В 0,5 г или в 0,5 куб. см не допускается
Фаршевые консервы из мяса птицы	В 0,5 г или в 0,5 куб. см не допускается
Паштетные консервы из мяса птицы	В 0,5 г или в 0,5 куб. см не допускается
Мясо-растительные консервы при закладке мяса птицы с: - предварительной тепловой  обработкой - без предварительной  тепловой обработки	В 0,5 г или в 0,5 куб. см не допускается В 0,5 г или в 0,5 куб. см не допускается
Мясо тушек птицы	В 0,1 г не допускается
Кусковое бескостное мясо птицы	В 0,1 г не допускается
Мясо птицы механической обвалки, полученное сепарированием	В 0,1 г не допускается
Бланшированное мясо птицы	В 0,1 г не допускается
Растительные компоненты	В 0,1 г не допускается
Микробиологические  показатели пастеризованных консервов из мяса птицы
Наличие Сlostridium botulinum	В 0,1 г не допускается

 

2. Федеральный закон от 27.10.2008 N 178-ФЗ “Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей”

Допустимые микробиологические показатели продукта
Соковая продукция  из фруктов или овощей	Показатель безопасности Cl.botulinum
Из фруктов с рН 4,2 и  >, а также рН 3,8 и > для соковой продукции из абрикосов, персиков, груш	Не допускается в 1г
Из фруктов с рН < 4,2, а также рН < 3,8 для соковой продукции из абрикосов, персиков, груш	Не нормируется
Томатная с содержанием сухих веществ < 12 %	Не допускается в 1 г
Из овощей с рН 4,2 и >	Не допускается в 1 г
Из овощей с рН 3,7 – 4,2	Не допускается в 1 г
Из овощей с рН < 3,7	Не нормируется

 

3. Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299 (ред. от 06.11.2012) “О применении санитарных мер в таможенном союзе”

Показатели безопасности Сlostridium botulinum
Консервы из мяса, в т.ч. с добавлением субпродуктов	не более 1 клетки в 10 г (см3) продукта
Мясо-растительные консервы	не более 1 клетки в 10 г (см3) продукта
Рыбные консервы	не более 1 клетки в 10 г (см3) продукта
Рыбо-растительные консервы	не более 1 клетки в 10 г (см3) продукта

 

 

 

 

 

II. СОБСТВЕННЫЕ  ИССЛЕДОВАНИЯ.

 

2.1. Отбор и подготовка  пробы продукта.

 

Методы отбора проб пищевых  продуктов – по ГОСТ 26668-85. Пробы пищевых продуктов подготавливаю к анализу по ГОСТ 26669-85. Консервы и полуконсервы проверяют на герметичность по ГОСТ 8756.18-70.

Перед отбором проб визуально  определяют внешний вид упаковочных  единиц и (или) продукта, попавших в  выборку, и подразделяют их на нормальные по внешнему виду, подозрительные и испорченные. Отбор проб от продукции проводят по каждому виду отдельно.

Упаковку пробы очищают  от загрязнений. Если на анализ поступили  герметично укупоренные пробы продукта, то проверяют герметичность тары. Герметичность консервов определяют при помощи вакуума или помещением в воду, герметичность полимерной тары с продуктом, а также консервов, укупоренных крышками с упругой  мембраной – визуально. Поверхность  упругой мембраны должна быть вогнута  внутрь. Герметично укупоренную тару моют, ополаскивают и высушивают. Негерметичную  упаковку с продуктом протирают  тампоном, смоченным этиловым спиртом.

Консервы, предназначенные  для выявления в них ботулинических токсинов термостатированию не подлежат.

Микробиологический анализ нормальных по внешнему виду проб продукта проводят в боксе с соблюдением  условий асептики. Упаковку пробы  подозрительного по внешнему виду или  испорченного продукта вскрывают в  отдельном помещении.

Перед вскрытием тару перемешивают 10-кратным переворачиванием тары с  донышка на крышку. Упаковку с пробой продукта (кроме консервов) протирают  тампоном, смоченным в этиловом спирте, затем упаковку вскрывают, и горлышко обжигают. После чего отбирают навеску  продукта для исследования.

Отобранные навески продукта немедленно высевают в питательные  среды.

 

2.2. Выявление ботулинистических токсинов.

 

Для этого необходима биологическая  проба на белых мышах. С этой целью  отбирают 100 мл жидкого продукта или  экстракта, полученного с физиологическим  раствором из продуктов плотной  консистенции.

Из плотного продукта исходную жидкость получают следующим образом: продукт предварительно измельчают ножницами, переносят в стерильную ступку и растирают до однородной консистенции, постоянно добавляя физиологический  раствор до соотношения 1:1 или 1:2. Полученные смеси выдерживают при 4±2° в  течение 2 часов. Затем отделяют жидкую фракцию отстаиванием и фильтрованием  через ватно – марлевый фильтр, не адсорбирующий ботулинические токсины.

Исходную жидкость переносят  в две пробирки пипеткой с резиновой  грушей по 2-3 мл, в третью вносят 2,7 мл жидкости и 0,3 мл раствора трипсина или  панкреатина, устанавливают рН 6±1. Содержимое первой пробирки оставляют без обработки, второй – кипятят на водяной бане 10 минут и охлаждают до комнатной  температуры. Третью пробирку (с ферментом) термостатируют при 37°С 1 час, периодически перемешивая содержимое. Обработка протеолитическим ферментом необходима для выявления протоксина Сlostridium botulinum, активизирующегося под действием трипсина. Биологическую пробу ставят непосредственно после окончания обработки исходной жидкости протеолитическим ферментом.

Фильтрат из каждой пробирки вводят двум белым мышам массой 16-18 г внутривенно или внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл. при наличии ботулинического токсина животные, зараженные непрогретым фильтратом или только фильтратом, обработанным трипсином, заболевают и погибают в течение 2-5 суток, а иногда даже в течение первых 4-12 часов с характерной клинической картиной ботулизма. Шерсть у мышей взъерошена, дыхание затруднено, мышцы брюшной стенки ослаблены и западают – “осиная талия”, наблюдаются судороги, паралич задних конечностей и смерть. Мыши, которым введена исходная жидкость без трипсина, могут переболеть и остаться живыми или погибнуть позже.

 

 

Тип ботулинистического токсина  определяют в реакции нейтрализации. Вначале ставят РН со смесью противоботулинистических сывороток. Смешивают равные объемы моновалентных сывороток типов А, В, С, Е, F, и 0,6 мл полученной смеси добавляют в пробирку к 2,4 мл исследуемого фильтрата. В другую (контрольную) пробирку к 2,4 мл исследуемого фильтрата добавляют 0,6 мл физиологического раствора. Содержимое пробирок перемешивают и выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре. Для биологической пробы анализируемый фильтрат сначчала отбирают из контрольной, а затем из опытной пробирки по 1 мл вводят двум белым мышам. Наблюдение за животными ведут на протяжении 2, 4, 6, 24 часов и в течение 4 суток. У мышей, которым вводили смешанный с сывороткой фильтрат, признаков заболевания ботулизмом не наблюдается.

Затем ставят развернутую РН с моновалентными, типоспецифическими, антитоксическими, диагностическими сыворотками. Для этого в шесть пробирок разливают по 2,4 мл фильтрата. Затем в пять из них добавляют по 0,6 мл сыворотки типов А, В, С, Е, F, а в шестую – 0,6 мл физиологического раствора (контроль). Приготовленную смесь выдерживают в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего вводят по 1 мл каждой смеси внутрибрюшинно двум мышам. Для взятия пробы из каждой пробирки используют чистый шприц. Результаты учитывают в течение четырех суток каждые 4-6 часов, затем – через 24 часа. Мыши, которым была введена смесь токсина и гомологичной сыворотки, выживают, остальные погибают.

Если необходимо выделить культуру токсигенных штаммов Сlostridium botulinum, производят посев из продукта на специальные плотные питательные среды с последующим определением морфологических и биохимических признаков, характерных для Сlostridium botulinum. При подозрении на присутствие вегетативных клеток Сlostridium botulinum для посева, согласно ГОСТ 10444.7-86, используют печеночно – глицериновую, улучшенную клостридиальную среду, бульон с кониной и мальтозой, а также среду Китта-Тароцци – без предварительной обработки. Для выявления в продукте спор Сlostridium botulinum используют те же среды, прогревая посевы при 80±1°С в течение 15 минут.

При подозрении на присутствие  спор Сlostridium botulinum типов А, В, С, D, F, не разлагающих казеин, применяют также триптозопептонную-глюкозную среду с дрожжевым экстрактом и среду Хоттингера.

Навески продукта вносят на самое дно пробирки с питательной  средой. Одну из навесок перед посевом  смешивают с равным объемом 96%-го этанола в колбе с притертой пробкой, периодически встряхивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 1часа, а затем вносят питательную среду.

Посевы термостатируют до 14 суток, после появления признаков  роста выдерживают в термостате еще 5 суток, затем переносят в  холодильник и хранят при 4±2°С.

Морфологические и культурально – биохимические особенности  Сlostridium botulinum изучают непосредственно после обнаружения признаков роста в питательных средах, а затем на 3 и 5 сутки. С этой целью со дна пробирки отбирают пастеровской пипеткой культуральную жидкость, готовят мазки. Окрашивают их по Граму и на споры, определяют подвижность, ставят реакцию на каталазу (Сlostridium botulinum каталазоотрицательны).

Одновременно проводят пересев  пастеровской пипеткой (посев частым штрихом с площадкой или по секторам) на плотные питательные  среды для выделения чистой культуры. Рекомендуется использовать печеночно-желточный  агар и глюкозо-кровяной агар. Предварительно создав анаэробные условия, посевы помещают в термостат на 48 часов при 30-36°С.

На поверхности плотных  питательных сред Сlostridium botulinum образует прозрачные, выпуклые или плоские, немного расплывчатые колонии неправильной формы с ровными или изрезанными краями. На печеночно-желточном агаре колонии окружены “жемчужной” зоной лецитиназной активности, которая повторяет их контур. На сахарном кровяном агаре колонии (кроме типа G) окружены зоной бета-гемолиза.

Для дальнейшего изучения отбирают 5-10 колоний с характерными свойствами. Колонии эмульгируют  в физиологическом растворе и  пересевают на желатин-лактозную среду, полужидкие среды Гисса с глюкозой (разлитые высоким столбиком) с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой, сахарозой, салицином, на среду с калия нитратом и на бульон Хоттингера с закрепленной под пробкой индикаторной бумажкой на сероводород. Культивируют в анаэробных условиях при 30-36°С. Учет проводят через 24-48 часов. К виду Сlostridium botulinum относят микроорганизмы, если они не ферментируют лактозу, сахарозу, маннит, способность сбраживать глюкозу, мальтозу и салицин варьирует, разжижают желатин, нитраты не восстанавливают, индол не образуют, выделяют сероводород.

При обнаружении клостридий и ботулинистического токсина или  протоксина в культуральной жидкости посева навески продукта считают, что  в продукте присутствует токсигенный  штамм Сlostridium botulinum. При выявлении в посевах даже одной колонии клостридий, способной образовывать ботулинический токсин или протоксин, считают, что в продукте содержится токсигенный штамм Сlostridium botulinum.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВЫВОДЫ ПО ИТОГАМ КУРСОВОЙ РАБОТЫ

 

В вопросах профилактики ботулизма  очень важным фактором является тщательная обработка продуктов перед консервированием, приготовлением. Возбудитель ботулизма  широко распространен в природе  – в почве, в иле. Почва является основным источником обсеменения спорами  возбудителя ботулизма, через поврежденную поверхность выловленной рыбы с  частичками почвы они могут попадать в мышечную ткань, с илом - в кишечник рыб.

  Поэтому, чем чище  отмыты овощи перед  консервированием, чем тщательнее промыта рыба  перед посолом, тем меньше вероятность  попадания в продукт возбудителя  ботулизма. Рыбу перед посолом  в домашних условиях необходимо  освободить от внутренностей  и тщательно промыть и внутреннюю поверхность.

  Грибы полностью освободить  от микрочастиц почвы очень  сложно, поэтому не следует консервировать  их  в герметично закрытых банках  в домашних условиях, т.к. возбудитель  ботулизма развивается в условиях  отсутствия доступа кислорода  (герметично закрытые консервы, плотная  консистенция толщи мышц рыбы, мяса).