Качественные реакции на аминокислоты белки

Практическая  работа 1

КАЧЕСТВЕННЫЕ  РЕАКЦИИ НА АМИНОКИСЛОТЫ И БЕЛКИ

Опыт 1.  Реакции на ароматические  аминокислоты (реакции  нитрования)

Ход работы: В  первую пробирку наливают 1 мл 1 %-ного  раствора тирозина, во вторую  -  1 мл 1 %-ного  раствора  овальбумина (раствор яичного белка), в третью - 1 мл 1 %-ного  раствора зеина, в четвертую - 1 мл 1 %-ного  раствора желатина. Затем во все пробирки добавляют по 3-5 капель конц. HNO3 до появления мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашивается в ярко-желтый цвет, осадок при этом постепенно растворяется (происходит гидролиз белка). Результаты опыта вносят в таблицу. (Образование желтых пятен на коже при попадании азотной кислоты обусловлено этой реакцией). 

Опыт 2.  Реакция Фоля

Ход работы: В  одну пробирку наливают 1 мл 1 %-ного раствора аминокислоты цистеин (контрольная проба), в остальные три пробирки наливают по 3 мл 1 %-ных растворов овальбумина, зеина и желатина, добавляют по 1 мл 30  %-ного  раствора NaOH, 1 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4  и 2-3 капли 5 %-ного раствора нитропруссида натрия. Раствор приобретает пурпурный цвет. Результаты опыта вносят в таблицу. 

Опыт 3. Реакция Сакагучи

Ход работы: В  одну пробирку наливают 1 мл 1 %-ного  раствора аргинина, в остальные три пробирки наливают по 1 мл 1 %-ных растворов овальбумина, зеина и желатина, добавляют по 1-2 капли 10 %-ного  раствора NaOH и затем по 1-2 капли спиртового раствора a-нафтола. Перемешивают, приливают по 1-2 капли гипохлорита натрия и вновь перемешивают. Развивается розово-красное окрашивание. Результаты опыта вносят в таблицу. 

Опыт 4. Реакция Адамкевича

Ход работы: в  одну пробирку наливают 1 мл 1 %-ного раствора триптофана, в остальные три пробирки наливают по 1 мл 1 %-ных растворов овальбумина, зеина и желатина. Затем в каждую пробирку добавляют по 1 мл конц. CH3COOH и, наклонив пробирку, по стенке, осторожно наливают по 1 мл конц. H2SO4 так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии на границе двух жидкостей образуется красно-фиолетовое кольцо. Результаты заносят в таблицу. 

Опыт 5. Биуретовая реакция на белки

Ход работы: В  три пробирки наливают по 1 мл 1 %-ных растворов овальбумина, зеина и желатина, добавляют 1-2 мл 10  %-ного  раствора NaOH и 1-2 капли 1 %-ного раствора CuSO4. При перемешивании появляется фиолетовое окрашивание. Результаты вносят в таблицу.

Оформление работы

1. Запротоколировать  таблицу.

Таблица

 

2. Сформулировать  выводы.

3. Ответить на  контрольные вопросы. 

Контрольные вопросы:

1. Основные функции  белков.

•2. Элементарный состав белков.

•3. Классификация  аминокислот.

•4. Физические свойства аминокислот. Понятие стереоспецифичности аминокислот.

•5. Кислотно-основные свойства аминокислот.

•6. Кривые титрования аминокислот. Понятие изоэлектрической точки (pI).

•7. Как с помощью  цветных реакций обнаружить в  белке аргинин?

•8. Как обнаружить в белке цистеин?

•9. Способ связи  аминокислот в белках.

10. Реакция на  пептидную связь. На какой реакции  основано количественное определение  белка биуретовым методом?

11. Аминокислотный  анализ. Метод ионообменной хроматографии. 

12. Нингидриновая реакция как способ обнаружения, идентификации и количественного анализа аминокислот. 

Практическая  работа  2

МЕТОДЫ  ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ ПУТЕМ ОСАЖДЕНИЯ

Опыт 1. Разделение альбуминов и глобулинов сыворотки  крови методом 

высаливания и определение их содержания

Ход работы. В  пробирку наливают 3 мл сыворотки крови  и прибавляют к ней равный объем  насыщенного раствора (NH4)2SO4 с образованием полунасыщенного раствора. Наблюдают  помутнение раствора  вследствие выпадения  осадка глобулинов. Пробу центрифугируют, затем осадок глобулинов растворяют в 2 мл 0,9  %-ного  раствора NaCl, добавляют 1 мл 30 %-ного раствора NaOH и 1 мл 1 %-ного раствора CuSO4, перемешивают и колориметрируют на ФЭКе в кюветах толщиной 1 см (l = 1 см), используя зеленый светофильтр (l = 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив.

Сглоб 1 = ..... о.е./3 мл сыворотки

Сглоб 2  = ....о.е./1 мл сыворотки.     

Опыт 2.  Количественное определение  суммарного белка  в сыворотке крови 

биуретовым методом

Ход работы. К 1 мл сыворотки крови добавляют 1 мл Н2О, 1 мл 30 %-ного раствора NaOH и 1 мл 1 %-ного раствора CuSO4, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 минут для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе с соблюдением условий, описанных в первой части задания. В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе используют биуретовый реактив. Зная оптическую плотность (о.е) раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой находят в нём содержание белка: Сглоб  = ....мкг/мл сыворотки. 

Опыт 3. Распределительная  хроматография  аминокислот  на бумаге

Ход работы: Квадрат  хроматографической фильтровальной бумаги размером 11х11 см делят диагоналями на 4 части. В центре пересечения диагоналей описывается окружность радиусом 10 -11 мм, стороны квадрата нумеруют. На середину каждой их четырех дуг, ограниченных диагоналями, наносят микропипеткой пятнышко (2-3 мм в диаметре) из аминокислот "свидетелей" и анализируемую смесь аминокислот.

В центре квадрата иглой проделывают отверстие  и в него вставляют фитиль, скатанный  из небольшого треугольника фильтровальной бумаги в виде трубочки. На дно чашки  Петри наливают 10-15 мл смеси растворителей (бутанол, уксусная кислота, вода) так, чтобы было покрыто дно чашки. Квадрат помещают на чашку Петри так, чтобы он лежал на ее краях. Фитилек должен касаться дна чашки Петри. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре. По фитильку растворитель поднимается вверх, распределяется по бумаге от центра к периферии листа. Когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри (через 1 час), хроматограмму снимают, отмечают карандашом фронт растворителя, помещают ее на крышку чашки Петри и ставят в сушильный шкаф при температуре 100 - 130 °С на 5 минут (до исчезновения запаха растворителя). Высушенную хроматограмму проявляют 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и вновь помещают в сушильный шкаф. Через несколько минут на хроматограмме появляются пятна, указывающие положение аминокислот. 

Практическая  работа  3

СВОЙСТВА  ФЕРМЕНТОВ

Опыт 1.  Действие амилазы  на крахмал

Ход работы: В 10 пробирок наливают по 2-3 мл 0,5  %-ного раствора крахмала, затем быстро прибавляют, начиная от 1-ой к 10-ой пробирке, по 2-3 капли слюны. В первую пробирку сразу вносят каплю 0,1 %-ного раствора J2, в остальные пробирки раствор J2 добавляют с интервалами через 10-30 секунд. В пробирке, где желтый цвет раствора J2 не изменяется, гидролиз считают законченым. Затем проводят реакцию Троммера: пробирку с продуктами реакции подогревают - йод улетучивается. Прибавляют 4-5 капель 10 %-ного раствора NaOH и 5-7 капель 7 %-ного раствора CuSO4. Содержимое пробирок нагревают до кипения. Выпадает желтый (красный) осадок CuОН (Cu2О+Н2О), так как глюкоза обладает восстановительными свойствами. 

Опыт 2.  Термолабильность ферментов.

Ход работы: В 2 пробирки наливают по 5 капель слюны и по 1 мл Н2О. Одну пробирку с раствором  слюны кипятят в течение 2 минут,  другую - не кипятят. Добавляют по 10 капель 0,5 %-ного раствора крахмала и перемешивают. Через 5-10 минут проводят реакцию с йодом на крахмал и пробу Троммера на глюкозу.

Опыт 3.  Специфичность ферментов

Ход работы: 1) Получение  сахаразы. Навеску 0,5 г пекарских  дрожжей наносят тонким слоем  на стекло и подсушивают. Затем растирают  дрожжи в порошок в ступке для  разрушения клеточных стенок микроорганизмов, добавляют 5-кратный объем Н2О  и центрифугируют. Центрифугат служит источником фермента сахаразы.

2) Определение  субстратной специфичности ферментов  проводят следующим образом. В  2 пробирки наливают по 1 мл 0,5 %-ного раствора крахмала (субстрат) и добавляют в первую 0,5 мл слюны, разведенной в 5 раз водой (источник амилазы), а во вторую - 5 капель вытяжки из дрожжей (источник сахаразы). В две другие пробирки наливают по 1 мл 0,5 %-ного раствора сахарозы (субстрат), затем в первую пробирку добавляют 5 капель вытяжки из дрожжей (фермент сахараза), а во вторую - 0,5 мл слюны, разведенной в 5 раз водой (фермент амилаза). Пробы помещаю в водяную баню на 5-10 минут при 37 0С. Затем в пробирки с крахмалом добавляют 0,1 %-ного раствора J2 и отмечают окрашивание. В пробирках с сахарозой проводят пробу Троммера на глюкозу. 

Опыт 4.  Действие активаторов  и ингибиторов  на активность амилазы  слюны

Ход работы: В 3 пробирки наливают по 1 мл 0,5 %-ного раствора крахмала. В первую пробирку прибавляют 2 капли 1 %-ного раствора CuSO4, во вторую - 2 капли 1 %-ного раствора NaCl, третью - оставляют контрольной. В каждую пробирку вносят по 5 капель слюны. Затем через 5-10 минут добавляют по 1 капле раствора йода. Различная окраска проб обусловлена степенью гидролиза крахмала и свидетельствует об активирующем или ингибирующем  действии солей.  

Практическая  работа 4

ВИТАМИНЫ. КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ  НА ВИТАМИНЫ Е, В6 и В5, РР

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С

Опыт 1.  Качественная реакция  на витамин РР

Ход работы: К 1 мл чая (источник витамина РР) добавить 5 мл 2 %-ного раствора NaOH и 1 мл 10 %-ного раствора CuSO4. Выпадает  осадок синего цвета. 

Опыт 2. Качественная реакция  на витамин В6

Ход работы: К 1 мл 1 %-ного раствора витамина В6 приливают равное количество 1 %-ного раствора FeCl3, перемешивают. Образуется комплексная соль типа фенолята железа красного цвета. 

Опыт 3. Качественная реакция  на витамин Е

   Ход работы: В сухую пробирку берут 4-5 капель 0,1 %-ного спиртового раствора a-токоферола и добавляют 2-3 капли конц. HNO3. Содержание пробирки перемешивают, нагревают в течение 5 минут на водяной бане при 80 0С до появления красно-оранжевого окрашивания.

Практическая  работа 5

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНА С

Ход работы: а) Взвешивают три навески овощей по 1 г. Первую навеску  растирают: с 10 мл Н2О, вторую - с 10 мл 2 %-ного раствора HCl и третью - с 10 мл 1 %-ного раствора  NaOH. Затем все пробы отфильтровывают.

б) В 3 колбы для  титрования отмеряют по 5 мл приготовленных фильтратов. Пробы титруют 0,001 Н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления  розового окрашивания, не исчезающего  в течение 30 секунд.

Реакция идет следующим  образом:

в) Расчет. Допустим, на титрование 5 мл вытяжки расходуется  Х мл 0,001 Н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола. Известно, что 1 мл 0,001 Н раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола  соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты. Значит, в 5 мл вытяжки содержится Х  · 0,088 мг аскорбиновой кислоты. Во всей вытяжке (10 мл) содержится Х · 0,088 · 2 мг аскорбиновой кислоты. Следовательно, 1 г продукта содержит Х ·  0,088 ·  2 мг, а 100 г продукта - Х ·  0,088 · 2 ·  100 = 17,6 · Х мг аскорбиновой кислоты. Эта величина соответствует  содержанию вещества, выраженному в  мг % (количество вещества в мг в 100 г  ткани).

Практическая  работа  6

НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

ВЫДЕЛЕНИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОПРОТЕИДОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ПРОДУКТОВ ИХ ГИДРОЛИЗА

Опыт 1.  Выделение  дезоксирибонуклеопротеида и его гидролиз

Ход работы: 1 г  печени  крупного рогатого скота  тщательно растирают с песком на холоду. Затем небольшими порциями добавляют в ступку сначала 5 мл 1М раствора NaCl, тщательно растирают в течение 10-15 минут. Перемешивая содержимое, добавляют еще 5 мл 1 М раствора NaCl. Полученный вязкий раствор центрифугируют 15 минут. К надосадочной жидкости после центрифугирования добавляют шестикратный объем Н2О (воду добавляют медленно, тонкой струей), размешивая жидкость деревянной палочкой. Нити дезоксирибонуклеопротеида наматывают на палочку и осторожно переносят в пробирку. Часть нитей переносят в пробирку и добавляют 5 мл 10 %-ного раствора H2SO4, закрывают пробирку пробкой с обратным холодильником и ставят в кипящую водяную баню на 1 час. Гидролизат после охлаждения отфильтровывают и проделывают качественные реакции.