Бактерии в сельском хозяйстве

    Препарат  клубеньковых бактерий может выпускаться  и в виде ризоторфина. Впервые  торфяной препарат клубеньковых бактерий был приготовлен в 30-х годах, но технология была создана в 1973-77 гг.

    Приготовление:  для производства ризоторфина торф сушат при температуре не выше 100С и размалывают в порошок. Наиболее эффективным способом стерилизации является облучение его гамма-лучами. Перед стерилизацией размолотый, нейтрализованный мелом и увлажненный до 30-40% торф расфасовывают в полиэтиленовые пакеты. Затем его облучают и заражают клубеньковыми бактериями, используя шприц, с помощью которого впрыскивается питательная среда, содержащая клубеньковые бактерии. Прокол после внесения бактерий заклеивается липкой лентой. Каждый грамм ризоторфина должен содержать не менее 2.5 млрд. жизнеспособных клеток с высокой конкурентоспособностью и интенсивной азотфиксацией. Препарат хранят при температуре 5-6С и влажности воздуха 40-55%. Пакеты могут быть весом от 0.2 до 1.0 кг. Доза препарата составляет 200 г на га. Заражение семян производят следующем образом: ризоторфин разбавляют водой и процеживают через двойной слой марли. Полученной суспензией обрабатывают семена. Семена высевают в день обработки или на следующий. 

    Обработка семян бобовых культур прочно вошла в мировую сельскохозяйственную практику. Крупнейшими производителями таких препаратов являются США и Австралия. 

      Производство азотобактерина 

    Азотобактерин - бактериальное удобрение, содержащее свободноживущий почвенный микроорганизм Azotobacter chroococcum, способный фиксировать до 20 мг атмосферного азота на 1 г использованного сахара. Внесенные в качестве удобрения в почву бактерии также выделяют биологически активные вещества (никотиновую и пантотеновую кислоты, пиридоксин, биотин, гетероауксин, гиббереллин и др.). Эти вещества стимулируют рост растений. Кроме того, продуцируемые Azotobacter фунгицидные вещества из группы анисомицина угнетают развитие некоторых нежелательных микроскопических грибов в ризосфере растения.

    Все виды Azotobacter строгие аэробы. Чувствительны к содержанию в среде фосфора и развиваются лишь при высоком его содержании в питательной среде. Азотфиксирующая способность культуры подавляется аммиаком (вообще содержание в среде связанного азота угнетает азотфиксацию). Стимулируют процесс фиксации азота соединения молибдена. 

    Установлено, что при фиксации азота процесс  его восстановления протекает на одном и том же синтезируемом  азотобактером ферментном комплексе  и лишь конечный продукт (аммиак) отделяется от фермента. Нитрогеназная азотфиксирующая система представляет собой мультиферментный комплекс, содержащий не связанное с геном железо, молибден и SH-группы. 

    Микробиологическая  промышленность выпускает несколько  видов азотобактерина: сухой, почвенный и торфяной. Технология получения сухого азотобактерина имеет много общего с технологией производства сухого нитрагина. Сухой азотобактерин - активная культура высушенных клеток азотобактера с наполнителем. В 1 г препарата содержится не менее 0.5 млрд. жизнеспособных клеток.

    Приготовление: культуру микроорганизма выращивают методом глубинного культивирования на среде, содержащей те же компоненты, что и при культивировании клеток Rhizobium. Дополнительно вводят только сульфаты железа и марганца, а также сложную соль молибденовой кислоты, рН 5.7-6.5. Процесс ферментации проводят до стационарной фазы развития культуры, так как в этой фазе биологически активные вещества выделяются из клетки и остаются в культуральной жидкости. Биологически активные вещества могут также полностью или частично теряться при высушивании, однако жизнеспособные клетки быстро восстанавливают способность их продуцировать. Высушенную культуру стандартизируют, фасуют в полиэтиленовые пакеты по 0.4-2 кг и хранят при температуре 15С не более 3 месяцев. 

    Почвенный и торфяной азотобактерин представляют собой активную культуру азотобактера, размноженную на твердой питательной  среде, и содержат в 1 г не менее 50 млн. жизнеспособных клеток.

    Приготовление: для их изготовки берут плодородную почву или разлагающийся торф с нейтральной реакцией среды. К просеянному субстрату добавляют 2% извести и 0.1% суперфосфата. По 500 г полученной смеси переносят в бутыли емкостью по 0.5 л, увлажняют на 40-60% по объему водой, закрывают ватными пробками и стерилизуют. Посевной материал готовят на агаровых средах, содержащих 2% сахарозы и минеральные соли. Когда агар полностью покрывается слизистой массой коричневого цвета, полученный материал стерильно смывается дистиллированной водой и переносится на приготовленный субстрат. Содержимое бутылок тщательно перемешивают и термостатируют при 25-27С. Культивирование продолжают до тех пор, пока бактерии не размножатся до необходимого количества. Полученный препарат сохраняет свою активность в течение 2-3 месяцев. 

    Использовать азотобактерин рекомендуется только на почвах, содержащих фосфор и микроэлементы, также его применяют для бактеризации семян, рассады, компостов. При этом урожайность увеличивается на 10-15%. Семена зерновых опудривают сухим азотобактерином из расчета 100 млрд. клеток на 1 гектарную порцию семян. Картофель и корневую систему рассады равномерно смачивают водной суспензией бактерий. Для получения суспензии 1 гектарную норму (300 млрд. клеток) разводят в 15 литрах воды. При обработке почвенным или торфяным азотобактерином семена перемешивают с увлажненным препаратом и для равномерного высева подсушивают. Корневую систему рассады смачивают приготовленной суспензией. 

      Производство фосфобактерина 

    Фосфобактерин - бактериальное удобрение, содержащее споры микроорганизма Bacillus megaterium var. phosphaticum. Представляет собой порошок светло-серого или желтоватого цвета.

    Бактерии  обладают способностью превращать сложные  фосфорорганические соединения (нуклеиновые  кислоты, нуклеопротеиды и т.д.) и  трудноусвояемые минеральные фосфаты в доступную для растений форму. Кроме этого бактерии вырабатывают биологически активные вещества (тиамин, пиридоксин, биотин, пантотеновую и никотиновую кислоты и др.), стимулирующие рост растения. Фосфобактерин относится к числу препаратов со стимулирующим эффектом.

    Bacillus megaterium var. phosphaticum представляют собой мелкие, грамположительные аэробные спорообразующие палочки размером 2*6 мкм. Клетки содержат значительное количество соединений фосфора. В ранней стадии развития это подвижные одиночные палочки, при старении образуют эндоспоры, локализующиеся в одном из концов клетки. В силу вышеизложенного технология выращивания сводится к получению спор.

    Приготовление: в целом производство фосфобактерина похоже на производство азотобактерина и препаратов клубеньковых бактерий. Состав питательной среды в процентах: кукурузный экстракт -1.8, меласса - 1.5, сульфат аммония - 0.1, мел - 1, остальное - вода. Культивирование ведется глубинным методом в строго асептических условиях при постоянном перемешивании и принудительной аэрации до стадии образования спор. Основные параметры проведения процесса: температура 28-30оС, рН 6.5-7.5, длительность культивирования 1.5-2 суток. Полученную в ходе культивирования биомассу клеток отделяют центрифугированием и высушивают в распылительной сушилке при температуре 65-75оС до остаточной влажности 2-3%. Высушенные споры смешивают с наполнителем. Готовый препарат должен содержать не менее 8 млрд. клеток в 1 г. Расфасовывают препарат в полиэтиленовые пакеты по 50-500 г. В отличие от нитрагина и азотобактерина фосфобактерин обладает большей устойчивостью при хранении. Фосфобактерин рекомендуют применять на черноземных почвах, которые содержат наиболее значительное количество фосфороорганических соединений. Необходим для повышения урожайности зерновых, картофеля, сахарной свеклы и др. сельскохозяйственных растений. Семена обрабатывают смесью сухого фосфобактерина с наполнителем (золой, почвой и др.) в соотношении 1:40. На 1 гектарную порцию требуется 5 г препарата и 200 г наполнителя. Клубни картофеля равномерно увлажняют суспензией спор, приготовленной из расчета 15 г препарата на 15 л воды. Урожай при этом повышается на 10%. Кроме вышеупомянутых, достаточно большое распространение получил также биопрепарат АМБ (аутохтонная микрофлора Б), представляющий собой готовое сообщество микроорганизмов, нативную микрофлору почвы, способную разлагать органические вещества, высвобождая газообразный аммиак – то есть вести процесс нитрификации или аммонификации. Препарат АМБ применяется в тех случаях, когда почва обеднена и не имеет достаточного количества нативных микроорганизмов для проведения сельскохозяйственной деятельности. Кроме АМБ известен также вид препаратов ЭМ, который отличается от АМБ тем, что содержит не все почвенные бактерии подряд, а только их "элитных" представителей. В настоящее время ЭМ-препараты представляются одним из наиболее прогрессивных направлений развития биопрепаратов сельского хозяйства. 

В общем, схему  производства бактериальных удобрений  можно свести к следующим стадиям:

• Подбор чистой культуры бактерий и внесение ее в благоприятную среду.
• Культивирование со значительным наращиванием биомассы.
• Выделение и выпуск готового продукта.

    Процесс приготовления бактериального удобрения 

    Рассмотрим  процесс приготовления бактериального удобрения более подробно. Весь цикл состоит из 5 этапов, каждый из которых, в свою очередь, подразделяется на несколько шагов: 

Приготовление инокулята:

• Подбор штамма бактерий, обладающего требуемыми свойствами (достаточная скорость роста, обязательно устойчивость к сухим условиям, и ряд свойств, необходимых для конечного продукта)
• Засев на твердую питательную среду. Производится в лабораторных условиях при соблюдении стерильности. Требуется для первоначального наращивания биомассы.
• Пересев на жидкую питательную среду. Также проводится в лабораторных условиях. Необходим для получения количества биомассы, достаточного для помещения в ферментер большого объема.

Приготовление среды:

    Этот  процесс идет параллельно с приготовлением инокулята, питательная среда также используется для предварительного наращивания биомассы бактерий. Состав среды подбирается индивидуально для каждого вида бактерий. Для увеличения эффективности процесса ферментации зачастую требуется достаточно трудоемкий предварительный этап подбора оптимального состава питательной среды.

• Подбор оптимального состава питательной среды, если требуется (при модернизации производства, при использовании нового штамма бактерий и т.д.).
• Приготовление требуемого количества среды.
• Стерилизация среды.

Ферментация:

    Процесс ферментации проводится как правило  глубинными методами в таре, предназначенной  для конечного продукта, в помещениях, обеспеченных оптимальными для процесса условиями; реже — в ферментерах. Условия культивирования строго асептические, температурный режим как правило 26-30°С, pH среды нейтральная (6,5 — 7,5). Продолжительность культивирования зависит от требуемого количества биомассы, вида микроорганизма и других условий, в общем подбирается экспериментальным путем. 

Сушка:

    Существует  несколько методов сушки, применяемых  в производстве бактериальных удобрений  — сублимационная сушка, применение распылительных, ленточных и др. сушилок. Выбор метода сушки и  условий процесса (температурный  режим, требуемая остаточная влажность) определяются, исходя из эксплуатационных требований получаемого удобрения и того, какие микроорганизмы взяты для производства. 

Фасовка и выпуск продукта:

    Зачастую, стадия фасовки готового удобрения  мало выделяется среди предшествующих стадий производства. Это связано с тем, что во многих случаях культивирование микроорганизмов производится непосредственно в товарной упаковке (например, ризоторфин — в ПЭ пакетах (предварительно в них расфасована подготовленная среда - торф), азотобактерин — в стеклянных бутылях и т.д.). Во многом это связано с тем, что срок хранения готового продукта очень недолог, поэтому экономически наиболее приемлема скорейшая его реализация. В других случаях производится сортировка, отбор, фасовка и упаковка готового продукта, для чего может потребоваться введение отдельной производственной линии. 

    Производство  молочнокислой продукции 

    Молочнокислое брожение - процесс анаэробного окисления  углеводов, конечным продуктом при  котором выступает молочная кислота. Для молочнокислых бактерий является основным путем катаболизма углеводов и основным источником энергии в виде АТФ. Также молочнокислое брожение происходит в тканях животных в отсутствии кислорода при больших нагрузках.

    Данный  тип бактериального брожения используется для консервации продуктов питания (за счет ингибирования роста микроорганизмов молочной кислотой и понижения рН) с целью длительного сохранения (пример- квашение овощей, сырокопчение), приготовлении кисломолочных продуктов (кефира, ряженки, йогурта, сметаны), силосовании растительной массы, а также биотехнологического способа производства молочной кислоты. 

    Виды  молочнокислого брожения 

    Различают так называемые гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое брожение, в зависимости от выделяющихся продуктов помимо молочной кислоты и их процентного соотношения. Отличие также заключается и в разных путях получения пирувата при деградации углеводов гомо- и гетероферментативными молочнокислыми бактериями. 

• Гомоферментативное  молочнокислое брожение - углевод сначала окисляется до пирувата по гликолитическому пути, затем пируват восстанавливается до молочной кислоты НАДН+Н (образовавшегося на стадии гликолиза при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата) при помощи лактатдегидрогеназы. От стереоспецифичности лактатдегидрогеназы и наличия лактатрацемазы зависит, какой энантиомер молочной кислоты будет превалировать в продуктах- L-, D- молочная кислота или же DL-рацемат. Продуктом гомоферментативного молочнокислого брожения является молочная кислота, которая составляет не менее 90 % всех продуктов брожения. Примеры гомоферментативных молочнокислых бактерий: Lactobacillus casei , L. acidophilus , Streptococcus lactis.
• Гетероферментативное молочнокислое брожение - в отличие от гомоферментативного брожения, деградация глюкозы идет по пентозофосфатному пути, образующийся из ксилулозо-5-фосфата глицеральдегид-3-фосфат окисляется до молочной кислоты, а ацетилфосфат восстанавливается до этанола (некоторые гетероферментативные молочнокислые бактерии окисляют полученный этанол частично или полностью до ацетата). Таким образом, при гетероферментативном молочнокислом брожении образуется больше продуктов: молочная кислота, уксусная кислота, этанол, двуокись углерода. примеры гетероферментативных молочнокислых бактерий: L. fermentum, L. brevis, Leuconostoc mesenteroides, Oenococcus oeni .