Современные методы исследования микробной клетки

№ 15. Процесс реплдикации осуществляется с помощью ферментов, которые получили название ДНК-полимераз. Участок молекулы ДНК, в котором начали расплетаться комплементные нити, называется вилкой репликации. Она образуется у прокариот в определенной генетически детерминированной точке. В молекуле ДНК у эукариот таких точек инициации репликации («стартовых точек») бывает несколько. У эукариот процесс репликации ДНК идет неодинаково. Объясняется это тем, что полинуклеотидные цепи в молекуле ДНК антипараллельны, т. е. 5'-конец одной цепи соединяется с 3'-концом другой, и наоборот. Материнская цепь, на которой синтез идет от точки старта 5'->3' в виде сплошной линии, называется лидирующей, а вторая цепь, на которой синтез идет от 3'->5' (в противоположном направлении) отдельными фрагментами получила название запаздывающей. Синтез этой цепи сложнее синтеза лидирующей цепи. Он протекает с участием фермента лигазы отдельными фрагментами. Эти фрагменты (участки кодовой нити ДНК) содержат у эукариот 100-200, а у прокариот 1000-2000 нуклеотидов. Они получили название фрагментов Оказаки, по имени открывшего их японского ученого.

Фрагмент ДНК  от одной точки начала репликации до другой точки образует единицу  репликации - репликон. Репликация начинается с определенной точки (локус ori) и продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплеципрован. Молекулы ДНК прокариотических клеток содержат большое число репликонов, поэтому удваение ДНК начинается в нескольких точках. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.

Репликация  молекул ДНК у прокариот протекает  несколько иначе, чем у эукариот. У прокариот одна из нитей ДНК  разрывается и один конец ее прикрепляется  к клеточной мембране, а на противоположном  конце происходит синтез дочерних нитей. Такой синтез дочерних нитей ДНК получил название «катящегося обруча». Репликация ДНК протекает быстро. Так, у бактерии скорость репликации составляет 30 мкм в минуту. За минуту к нитке-матрице присоединяется около 500 нуклеотидов, у вирусов за это время - около 900 нуклеотидов. У эукариот процесс репликации протекает медленно. У них дочерняя нить удлиняется на 1,5-2,5 мкм в минуту.

ДНК всех живых  существ устроен одинаково. ДНК  разных видов различаются коэффициентом  видоспецифичности, который представляет собой отношение молекулярной суммы А + Т к молекулярной суме Г + Ц. Видоспецифичность ДНК выражается процентом или долей в ней ГЦ-пар. Коэффициент видовой специфичности разный у разных видов, но в общем наблюдается изменение ГЦ-пар от прокариот к эукариотам, а в пределах последних - от низших к более высокоорганизованным формам.

Углеводно-фосфатный  остов по всей длине во всех молекулах  ДНК имеет однотипную структуру  и не несет генетической информации. Наследственная информация зашифрована  различной последовательностью оснований. А если последовательность оснований определяет характер белков собаки, коровы, бактерии, вируса и т. д., то соответственная наследственность может передаваться из поколения в поколение.

Таким образом, в структорной организации молекулы ДНК можно выделить первичную структуру - полинуклеотидную цепь, вторичную структуру - две комплементарные друг другу полинуклеотидные цепи, соединенные водородными связями, и третичную структуру - трехмерную спираль с определенными пространственными характеристиками.

Биологами доказано, что синтез белка происходит не в  ядре, где локализована ДНК, а в  цитоплазме. Установлено, что непосредственного  участия в синтезе белка ДНК  не принимает. Роль посредника, функцией которого является перевод наследственной информации, хранящейся в ДНК, в рабочую форму, выполняют рибонуклеиновые кислоты (РНК). Рибонуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотидную цепь, состоящую из 4 разновидностей нуклеотидов, содержащих сахар рибозу, фосфат и одно из 4 азотистых оснований - аденин, гуанин, урацил, цитозин. Поэтому нуклеотиды молекулы РНК называются адениловой, гуаниловой, урациловой или цитидиловой кислотами. Молекулы РНК синтезируются на кодогенной цепи ДНК при помощи РНК-полимераз с соблюдением принципа комплементарности и антипараллельности. Особенностью является то, что аденину ДНК в РНК комплементарен урацил. Известно 3 основных вида РНК, действующих в клетке: информационная (и-РНК) или матричная, транспортная (т-РНК) и рибосомная (р-РНК).

Информация  о синтезе белка с определенными свойствами заключена в нуклеотидной последовательности матричных или информационных РНК (и-РНК, м-РНК), которые, в свою очередь, синтезируются на определенных участках ДНК. Процесс синтеза м-РНК называют транскрипцией. Синтез м-РНК начинается с обнаружения РНК-полимеразы, участка в молекуле ДНК, называемого промотором. В этом усатке РНК-полимераза раскручивает спираль ДНК и на одной из них фермент синтезирует м-РНК. Цепь, на которой происходит сборка молекул м-РНК, называют кодогенной. Сборка рибонуклеотидов в цепь происходит с соблюдением принципов комплементарности и антипараллельности, РНК-полимераза продвигается по кодогенной цепи ДНК и осуществляет синтез м-РНК до тех пор, пока не встречает на своем пути терминатор транскрипции (переписывания) - специфическую нуклеотидную последовательность. На участке расположения терминатора транскрипции РНК-полимераза отделяется от цепи ДНК и от синтезированной молекулы м-РНК. Промотор (участок молекулы ДНК), транскретируемая последовательность и терминатор образуют единицу транскрипции под названием транскриптон. После прохождения РНК-полимеразы вдоль молекулы ДНК, пройденные участки объединяются снова в двойную спираль. Образовавшаяся матричная РНК содержит точную информацию о белке, записанную в определенном участке ДНК. Три рядом расположенных нуклеотидов м-РНК шифрует последовательность аминокислот в пептидной цепи белков. Каждому триплету (три нуклеотида - кодон) соответствуют определенные аминокислоты. Существует большое разнообразие и-РНК. Объясняется это тем, что в клетке много разнообразных белков, строение каждого из которых кодируется своим геном, с которого и-РНК считывает информацию.

Транспортные  РНК характеризуются небольшими размерами. Они состоят из 75 - 90 нуклеотидов. В силу комплементарности разных участков они замкнуты на себя в нескольких местах, в результате чего вторичная структура представлена в виде клеверного листа с двухцепочным стеблем и тремя одноцепочными петлями. Известно более 60 т-РНК, которые отличаются между собой первичной структурой, т. е. последовательностью оснований. Каждая аминокислота присоединяется к определеной т-РНК. Характерной чертой т-РНК является наличие в головке средней петли трех нуклеотидов получивших название антикодон. Антикодон комплементарен определенному кодону м-РНК. При помощи антикодона т-РНК, кооперируясь с соответствующим кодоном и-РНК, обеспечивает включение определенной аминокислоты в полипептидную цепь синтезируемого белка.

Наследственная  информация, хранящаяся в молекулах  ДНК, затем «записанная» на м-РНК, расшифровывается благодаря двум процессам. Сначала фермент аминоацил- т-РНК-синтетаза обеспечивает содержание т-РНК с транспортируемой ею аминокислотой, затем аминоацил т-РНК комплементарно соединяе6тся с м-РНК благодаря взаимодействию антикодона с кодоном. Таким образом, с помощью т-РНК язык нуклеотидной цепи м-РНК переводится в язык аминокислотной последовательности пептида.

Предполагают, что боковые петли осуществляют связывание т-РНК с рибосомой  и со специфической аминоацил- т-РНК-синтетазой.

Перевод генетической информации с языка нуклеотидов  на язык аминокислот осуществляется на рибосомах. Рибосомы представляют собой  сложные комплексы рибосомной рибонуклеиновой  кислоты (р-РНК) и разнообразных белков. Рибосомная РНК является структурным  компонентом рибосом и обеспечивает связывание и-РНК с рибосомой в процессе биосинтеза белка и взаимодействие ее с т-РНК. Рибосомная РНК накапливается в ядрышках, где происходит образование субчастиц рибосом путем объединения белков с р-РНК. Затем субчастицы рибосом транспортируются через поры ядерной мембраны в цитоплазму.

Рибосомная  РНК имеет молекулярный вес 1,5-2 млн. и состоит из 4000-6000 нуклеотидов. Эта  нуклеиновая кислота, входящая в  состав рибосом, наряду с многочисленными  белками выполняет не только структурную, но ферментативную роль. Схема строения ДНК и участок двойной цепи этой кислоты представлены на рисунках 4 и 5.

9. Строение  и функционирование генома бактерий

Носителем генетической информации бактериальных клеток является ДНК. Она представляет собой двойную спираль, состоящую из двух полинуклеотидных цепочек. ДНК сравнивают с винтовой лестницей и с двойным электрическим кабелем. Остов ДНК состоит из фосфатных групп и дезоксирибозы. Полипептидные цепи соединены между собой водородными связями, которые удерживают друг с другом комплементарные азотистые основания. Строение ДНК бактерий аналогично таковому клеток эукариотического типа (растений, животных, грибов). В отличие от бактерий у вирусов геном представлен одной нуклеиновой кислотой - ДНК или РНК. Бактериальные клетки, кроме ДНК, могут иметь генетически полноценные образования функционирующие автономно. Необходимо подчеркнуть, что носителями наследственности бактерий кроме ДНК являются плазмиды и эписомы. В этой связи, любая структура бактериальной клетки, способна к саморепликации, называется репликон, т. е. репликонами бактерий являются нуклеотид, плазмиды, эписомы. Плазмиды не связаны с нуклеотидом, они пребывают в цитоплазме клетки автономно, эписомы могут находиться в свободном состоянии, но чаще всего они реплицируются вместе с ДНК.

Бактериальная хромосома представлена одной двунитевой молекулой ДНК кольцевидной формы  и называется нуклеотидом. Длина  нуклеотида в растянутом виде составляет примерно 1 мм. Нуклеотид - эквивалент ядра. Расположен он в центре бактерии. В отличие от эукариот ядро бактерий не имеет ядерной оболочки, ядрышка и основных белков (гистонов). Нуклеотид можно выявить в световом микроскопе. Для этого надо окрасить клетку специальными методами: по Фельгену или по Романовскому-Гимзе. Электронно-микроскопическое исследование показало, что один конец ДНК прикреплен к клеточной мембране. Видимо, это необходимо для процесса репликации ДНК.

В отличие от клеток эукариот у прокариот отсутствуют  митохондрии, аппарат Гольджи и  эндоплазмотическая сеть.

Каждая нить ДНК состоит из звеньев - нуклеотидов. В состав нуклеотида входит одно из азотистых оснований (аденин, гуанин, тимин или цитозин) дезоксирибоза  и фосфорная кислота. Приблизительно 1500 нуклеотидов составляют ген средней  величины. Таким образом, ген представляет собой определенный участок ДНК, ответственный за проявление и развитие конкретного признака. Гены в ДНК расположены линейно, они дискретны, способны к саморепликации. Последовательность аминокислот в синтезируемом белке, определяется последовательностью нуклеотидов в гене.

С точки зрения функциональной гены подразделяют на структурные, регуляторы, промоторы  и гены-операторы.

Структурные гены, представляют собой гены, обуславливающие  синтез ферментов, участвующих в  биологических реакциях и в формировании клеточных структур.

Гены-регуляторы ответственны за синтез белков, регулирующих обмен веществ. Эти гены могут  влиять на деятельность структурных  генов.

Гены-промоторы  детерминируют начало транскрипции. Они представляют собой участок ДНК, который распознает ДНК-зависимый РНК-полимеразой.

Гены-операторы  являются посредниками между структурными генами, промоторной областью и генами-регуляторами.

Совокупность  генов-регуляторов, промоторов, операторов и структурных генов называют опероном. Следовательно оперон является функциональной генетической единицей, несущей ответственность за проявление определенного признака микроорганизмов.

Различают индуцибельные  и репрессибельные опероны. Например, индуцибельным опероном является Lac-оперон, гены которого контролируют синтез ферментов, утилизирующих лактозу в микробной клетке. Если клетка не нуждается в лактозе, оперон поддерживается в неактивном состоянии и, наоборот.

Примером репрессибельного оперона может служить триптофановый  оперон, обеспечивающий продукцию триптофана. Этот оперон обычно постоянно функционирует, а его белок-репрессор находится в пассивном состоянии. В случае повышения содержания триптофана в клетке аминокислота вступает в связь с репрессором и активизирует его. Репрессор ингибирует работающий оперон и прерывает синтез триптофана.

Важнейшее свойство ДНК - способность к репликации. Репликация может протекать по тета-типу и  сигма-типу. Репликация ДНК по тета-типу начинается в определенной точке  в виде «вздутия» и распространяется вдоль молекулы в двух направлениях, проходя через промежуточную структуру, напоминающую греческую букву тета. При этом типе репликации сохраняется одна из цепей исходной молекулы ДНК, а вторая синтезируется из нуклеотидов.

Репликация  ДНК по сигма-типу осуществляется через промежуточную структуру, напоминающую греческую букву сигма, откуда и название этого типа. Этот тип репликации наблюдается в процессе коньюгации бактерий и некоторых фагов. При этом типе репликации происходит достраивание обоих нитей ДНК до двухцепочной ДНК.

Геном бактерий выполняет следующие функции:

обеспечивает  передачу биологических свойств  по наследству;

программирует синтез бактериального белка с определенными  свойствами;

участвует в  процессах изменчивости бактерий;

обеспечивает сохранение индивидуальности вида;

детерминирует множественную устойчивость к ряду лекарственных веществ.

Внехромосомные  факторы наследственности

К внехромомсомным факторам наследственности относят плазмиды и эписомы, которые  располагаются в цитоплазме клетки. Плазмиды не способны встраиваться в нуклеотид бактерии, они имеют собственную ДНК, которая может самостоятельно реплицироваться. В противоположность плазмидам, эписомы встраиваются в нуклеотид бактерии и функционируют вместе с ним.

Плазмиды, не зависимо от нуклеоида, обеспечивают способность к коньюгации, устойчивость к антибиотикам и другим веществам. Установлено, что наличие плазмид в клетке не обязательно, но в тоже время их может быть несколько. Плазмиды подразделяют на коньюгативные (трансмисивные) и неконьюгативные (на трансмиссивные). Первые - придают клетке свойства генетического донора, детерминируют перенос генетического материала от клетки донора к клетке реципиенту, вторые - не придают клетке свойств генетического донора, не могут передаваться к клетке реципиенту без наличия факторов переноса.

Различают следующие  виды плазмид: Соl-фактор - колициногенный фактор, F-фактор - фактор фертильности, R-фактор - фактор устойчивости к лекарственным  веществам, плазмиды биодеградации, плазмиды, кодирующие факторы вирулентности у микроорганизмов (Ent, Hly, Sal, K и т. д.)

Col-факторы - это плазмиды, контролирующие синтез  бактериоцинов, обладающих способностью  подавлять развитие филогенетических  родственных бактерий. Название  бактериоциногенов присваивают с учетом вида микроорганизмов их продуцирующих. В настоящее время известно, что практически почти все патогенные бактерии продуцируют бактериоцины.