Современные методы исследования микробной клетки

Углеводы. Из углеводов, содержащихся в растительных и животных клетках, с помощью цитохимических методов можно выявить как моносахариды, например глюкозу, так и разнообразные полисахариды.

Цитохимический  анализ полисахаридов основан на окислении их следующими окислителями: йодной кислотой, периодатом калия  и натрия, хромовой кислотой.

Цель окисления -- получение высокомолекулярных альдегидных соединений, которые затем выявляются реактивом Шиффа, подобно тому как это было только что указано для реакции Фельгена. Сама же реакция на полисахариды носит название реакции ШИК (Шифф-йодная кислота). Реактив Шиффа окрашивает разнообразные полисахариды, например гликоген, в яркий красно-фиолетовый цвет. Одновременно с гликогеном реактив Шиффа окрашивает в такой же яркий цвет другие полисахариды, и особенно кислые, типа мукополисахаридов, мукопротеидов и др. Для раздельного определения этих веществ используется приготовление контрольных препаратов, на которых гликоген удаляется из клеток обработкой птиалином слюны. Вещества же типа мукополисахаридов, мукопротеидов и кислые полисахариды типа гиалуроновой кислоты требуют применения специальных методов определения. Одна из реакций на такие соединения уже была названа выше: это явление метахромазии.

Гликоген на мазках, тотальных препаратах и срезах можно определить также путем  окрашивания йодом или раствором  Люголя (йод - 1 г, К! - 2 г, дистиллированная вода - 300 мл). Под действием йода гликоген окрашивается в красно-бурый или коричневый цвет.

Липоиды. Нейтральный  жир, находящийся в, цитоплазме клеток, избирательно окрашивается красным  Суданом III в оранжево-красный цвет и черным Суданом -- в черный цвет. Судан черный окрашивает и другие структуры "клеток, в которых содержатся липоиды. Имеется также ряд методов для определения в клетке веществ, содержащих в своем составе липоиды, например холестерин.

Ферменты. В  настоящее время методы цитохимии позволяют выявить около 50 различных ферментов, находящихся в клетках и тканях. Если при цитохимическом определении белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липидов выявляются какие-то структурные части их молекул, то при определении ферментов выявляется их активность.

Для того чтобы  обнаружить активность какого-либо фермента, клетки помещаются в среду, содержащую субстрат для данного фермента. Фермент  расщепляет субстрат, а последний  выбирается с таким расчетом, чтобы  один из продуктов расщепления можно было выявить при помощи цветной реакции. Очень важно, чтобы субстрат, участвующий в реакции, был хорошо растворим и легко проникал бы в клетку. Напротив, окрашенные конечные или промежуточные продукты реакции, не должны быть растворимыми и должны располагаться именно в тех частях клетки, где они находятся в прижизненном состоянии, а не диффундировать в соседние клетки или в другие части одной и той же клетки.

Примером реакций  определения ферментативной активности в клетках может служить реакция на сукцинатдегидрогеназу -- важнейший фермент, участвующий в окислительно-восстановительных процессах.

Основу этой реакции составляет восстановление с помощью этого фермента бесцветной и хорошо растворимой соли тетразолия (биосубстрат) в почти нерастворимый формазан (конечный продукт реакции), окрашенный в синий или сине-фиолетовый цвет.

При цитохимическом определении активности гидролитических  ферментов (фосфатазы, липазы и др.) в растворимые субстраты, которыми могут служить альфа и бетта-глицерофосфат, адено-зинтрифосфат и некоторые другие органические соединения, содержащие фосфор, добавляются ионы металлов.

В процессе расщепления таких  субстратов ферментами окрашенные продукты реакции осаждаются в местах ферментативной активности в виде малорастворимых солей кальция, свинца, меди, кобальта и других металло