Современные методы исследования микробной клетки

Бактериоцины  кишечной палочки называют колицины, стаффилококка - стаффилоцины, пневмококка - пневмоцины, вибриона - вибриоцины и т. д.. Лучше других бактериоцинов изучены колицины. Культуры кишечной палочки, продуцирующие колицины, называют колициногенами, а чувствительные к ним - колициночуствительными . Колицины - вещества белковой природы. Они обладают способностью ингибировать синтез ДНК, РНК, белка, вызывать гибель клетки не нарушая ее целостности. Колицины обладают летальным признаком, т. е. после их продукции бактериальная клетка может погибнуть. Колицины функционируют аналогично антибиотикам с узким спектром действия, обладают свойствами эндодезоксирибонуклеаз.

Бактериальные клетки, выделяющие бактерицины, устойчивы  к действию гомологичных бактерицинов окружающей среды.

F-фактор может  функционировать автономно и  может быть в интегрированном,  как эписома, состоянии. Этот фактор представляет собой кольцевую ДНК длиной 30-32 нм, молекула которой детерминирует перенос генетического материала из клетки донора в клетку реципиента, синтез половых ворсинок, синтез ферментов, способность к автономной репликации и т. д.

R-фактор генетическая  структура, обеспечивающая устойчивость  к лекарственным препаратам. Эта  структура несет гены лекарственной  устойчивости (ч-гены). Устойчивость  к одному или нескольким лекарственным  препаратам (антибиотикам) осуществляется  за счет оперонов и может быть передана путем коньюгации и трансдукции.

Плазмиды биодеградации  ответственны за использование органических соединений бактериями в качестве источников углерода и энергии, за утилизацию ряда сахаров, образование протеолитических ферментов.

Ent-плазмиды  кодируют образование энтеротоксинов  у энтеробактерий, Hly-плазмида - синтез  гемолизинов у энтеропатогенных  микроорганизмов и стрептококков. Sal-плазмида контролирует у псевдомонад  использование бактериями салицилатов  благодаря выработке предназначенного для этой цели фермента.

Последовательности  и транспозоны.

Кроме упомянутых выше генетических элементов (плазмиды, эписомы) у микроорганизмов наличествуют подвижные генетические элементы - последовательности и транспозоны, которые могут кодировать свою собственную транспозицию (перенос) от одного нуклеоида к другому или же между нуклеоидом и плазмидами. Такой перенос обусловлен способностью подвижных генетических элементов определять синтез ферментов транспозиции и рекомбинации - транспозаз.

Инсертиционные (вставочные) последовательности (is-элементы, от английского insertion - вставка, sequence - последовательность) обладают следующими свойствами. Они  способны перемещаться по геному, реплицируя при этом is-элемент. В процессе репликации первичный экземпляр остается на месте, а копия встраивается в мишень, почти не обладающей специфичностью. Функции, обеспечивающие способность к перемещению (транспозиции) закодированы в самом is-элементе. Транспозиция весьма редкое событие, которое происходит реже, чем спонтанные мутации. В местах смежных по отношению к инсерции возникают делеции и инверсии бактериальных геномов. Встроенная инсерция может либо активировать транскрипцию соседних генов, либо ингибировать их активность. Is-элементы обеспечивают взаимодействие между нуклеоидом, плазмидами и эписомами. В свободном состоянии is-последовательности не обнаружены.

Транспозоны состоят  из 2500-20000 и более пар нуклеотидов  и могут быть в свободном состоянии  в виде кольцевой молекулы, которая  обладает способностью перемещаться из хромосомы в плазмиды и наоборот, мигрируя с репликона на репликон. Некоторые умеренные фаги, например Ми-бактериофаг E. Coli, устроены аналогично и представляют собой гигантские транспозоны. Транспозоны могут быть носителями информации отвечающей за продуцирование токсинов и ферментов, ингибирующих антибиотики.

10. Биологический  синтез белка

Биологический синтез белка является очень сложным  многоступенчатым процессом. В настоящее  время доказано, что биосинтез  белка происходит не в ядре, а в цитоплазме. Непосредственного участия в синтезе белка ДНК не принимает. Роль посредника, функцией которого является перевод наследственной информации о химическом составе и структуре белков, хранящийся в ДНК, в полипептидную цепь определенного белка выполняют рибонуклеиновые кислоты (и-РНК, т-РНК). Большое значение в биосинтезе белка имеет информационная РНК. Она выполняет роль матрицы. Количество образующихся на ДНК молекул и-РНК определяется числом генов, контролирующих у определенного организма синтез специфических белков. Каждый белок требует для синтеза свой и-РНК, одна молекула которой «списывает» последовательность нуклеотидов с участка ДНК, равному одному гену, а затем, и-РНК переносит эту информацию на последовательность расположения аминокислот в полипептидной цепи белка. Информационная РНК из ядра проникает в цитоплазму и действует на рибосомах по отношению к белкам, как матрица.

Биосинтез белка  начинается с процесса под названием  транскрипция (от английского transcription - переписывание, копия). На участке определенного гена молекулы ДНК синтезируется м-РНК. Синтез м-РНК осуществляется с помощью многих ферментов, но главная роль принадлежит РНК-полимеразе, которая прикрепляется к начальной точке молекулы ДНК инициации транскрипции под названием промотор, расплетает двойную спираль и синтезирует м-РНК. Промотор расположен перед геном и у эукариотов включает около 80, а у вирусов и бактерий около 10 нуклеотидов.

РНК-полимераза движется вдоль гена и ведет синтез и-РНК. Синтезированная молекула м-РНК отделяется от ДНК, а участки гена на которых образовалась эта кислота, вновь соединяются. Окончание синтеза м-РНК определяет участок, который получил название - терминатор. Нуклеотиды промотора и терминатора узнают специфические белки, которые регулируют активность РНК-полимеразы.

В настоящее  время доказано, что сначала синтезируется  предшественни м-РНК так называемая про-м-РНК. Эта кислота имеет большие  размеры, чем м-РНК и содержит фрагменты не кодирующие синтез пептидной  цепи определенного белка. Связано это с тем, что в ДНК наряду с участками кодирующими р-РНК, т-РНК и полипептиды имеются фрагменты не несущие генетической информации. Эти фрагменты получили название интронов, а кодирующие фрагменты названы экзонами. После образования про-и-РНК, происходит процесс созревания м-РНК, который получил название процессинга. В процессе созревания м-РНК интроны удаляются специальными ферментами, а информативные участки (экзоны) соединяются между собой в строгом порядке с помощью ферментов лигаз. Этот процесс называется сплайсингом (от английского splice - сращивать). Биологическое значение и роль интронов остаются не ясными. Однако, установлено, что при считывании в ДНК только экзонов, зрелая м-РНК не образуется.

Следующим этапом биосинтеза является трансляция, которая происходит в цитоплазме на рибосомах. Суть ее в том, что последовательность расположения нуклеопептидов в м-РНК переводится в строго упорядоченную последовательность расположения аминокислот в молекуле синтезируемого белка. Этот процесс протекает при активном участии т-РНК и состоит из активирования аминокислот и непосредственного синтеза белковой молекулы. Свободные аминокислоты активируются и присоединяются к т-РНК при помощи фермента аминоацил-т-РНК-синтеталы. Активированные аминокислоты т-РНК доставляются на рибосомы. Эти органоиды цитоплазмы состоят из двух субчастиц, одна из которых имеет константу седиментации 30 S, вторая 50 S. Молекула м-РНК выходит из ядра в цитоплазму и прикрепляется к малой субчастице рибосомы. Сигналом к трансляции служит стартовый кодон АУГ. Когда т-РНК доставляет к рибосоме активированную аминокислоту, ее антикодон соединяется с комплементарным кодоном м-РНК. Акцепторный конец т-РНК с соответствующей аминокислотой присоединяется к поверхности большой субъединицы рибосомы. Затем следующая т-РНК доставляет следующую аминокислоту и т. д. Молекула м-РНК работает на нескольких рибосомах, соединенных в полисомы. Начало синтеза полипептидной цепи называется элонгацией. Окончание синтеза полипептидной цепи называется терминацией. Терминация наступает когда на м-РНК появляется один из кодонов-терминаторов УАА, УАТ или УГА.

Установлено, что  в клетках животных полипептидная  цепь удлиняется за 1 секунду на 7 аминокислот  м-РНК продвигается на рибосоме на 21 нуклеотид. У микроорганизмов процесс сборки полипептидной цепи протекает в 2-3 раза быстрее. Полипептидная цепь отделяется от рибосомы, высвобождаются т-РНК и м-РНК. Рибосома диссоциирует на субъединицы и вновь способна к синтезу следующей полипептидной цепи. Образующиеся в процессе синтеза белки начинают выполнять специфические функции, и в конечном счете, определяют признаки организма.

11. Изменчивость  бактерий

Наследственность  консервативна, она обуславливает  стабильность вида микроорганизмов, напротив, изменчивость является выражением способности вида приспосабливаться к постоянно меняющимся условиям его обитания. Наследственность и изменчивость неразрывно связаны между собой и размножением микроорганизмов. В популяции бактерий всегда появляются клетки, которые могут менять свои свойства. Если изменение признаков под влиянием факторов различного порядка, связаны с генотипом бактерий, то эти изменения передаются по наследству и могут быть положительно расценены естественным отбором. Новые признаки, обеспечивающие селективное преимущество, закрепляются естественным отбором, меняется генотип вида, осуществляется процесс эволюции.

У микроорганизмов  различают фенотипическую (модификационную, ненаследственную) и генотипическую (наследственную) изменчивость.

11.1. Фенотипическая  изменчивость

Фенотипическая  изменчивость является не наследуемым  типом изменчивости, т. е. это различия между микроорганизмами, одинаковыми  по генотипу. Эта изменчивость возникает  в результате постоянного воздействия  на клетку изменяющихся факторов среды  обитания. Сходные по генотипу, микроорганизмы могут существенно различаться по фенотипу, т. е. по способу проявления наследственных признаков.

На формирование фенотипа существенное влияние оказывают  факторы внешней среды. Известно, что генотипически идентичные организмы в различных условиях существования в определенной степени различаются по своим признакам. Например, изменение содержания жира в молоке животных или массы тела в зависимости от их кормления, изменение количества эритроцитов в крови в зависимости от порциального давления кислорода.

В отличает от особей высший организмов, у которых исследуются  признаки каждой особи, у микроорганизмов  изучают не признаки одной клетки, а всей культуры, которая включает миллиарды бактерий. Культуры микробов, выращенные на питательной среде, отличаются характером роста, физиологическими и биохимическими признаками. К морфологическим признакам относят окраску, размер, форму, наличие жгутиков, капсул, спор и т. д. К физиологическим признакам культур относятся способность расти при определенной температуре, устойчивость к химическим веществам, облучению, антибиотикам, фагам, различным ядам.

Примером модификационной  изменчивости у микроорганизмов  может быть образование различных  типов адгезинов у гонококка, необходимых для колонизации им кишечника. В качестве примера, можно привести увеличение сальмонелл при добавлении к питательной среде стрептомицина. При переносе таких сальмонелл в питательную среду без стрептомицина бактериальные клетки приобретают типичную для вида величину.

Модификации представляют собой изменения, которые поддерживаются пока действует неблагоприятный  фактор. Так, образование L-форм бактерий, лишенных клеточной стенки, происходит под влиянием химиотерапевтических веществ (пенициллина, стрептомицина  и т. д.). при снятии действия антибиотиков на культуру бактерий происходит реверсия микроорганизмов в исходные формы. Фенотипическое проявление признака под влиянием условий внешней среды возможно в определенных пределах, называемых нормой реакции, которая допустима генотипом организмов. Некоторые признаки характеризуются широкой нормой реакции. В основном, это количественные признаки (масса микробной клетки, ее величина, пигментация колоний).

Фенотипическое  проявление информации, заключенной  в генотипе, характеризуется показателями пенентрантности и экспрессивности. Пенетрантность отражает частоту фенотипического проявления имеющейся в генотипе информации, а экспрессивность характеризует степень выраженности признака.

Различают длительную модификацию, которая проявляется в течение нескольких поколений и кратковременную, при которой изменения исчезают при исчезновении действующего фактора внешней среды.

11.2 Генотипическая  изменчивость

Генотипическая  изменчивость связана с изменением генотипа бактерий. В основе генотипической изменчивости лежат мутации и рекомбинации.

Мутации (от латинского mutatio - изменение) - это изменения  структуры ДНК (качественные или  количественные), которые возникают  под влиянием эндогенных или экзогенных факторов и проявляются наследственно закрепленным изменением одного или многих признаков. В природе мутации возникают без участия экспериментатора и называются спонтанными, а мутации, контролируемые экспериментатором, называются индуцированными. Бактерии с измененными признаками называют мутантами. Спонтанные мутации возникают под влиянием неизвестных причин и лежат в основе эволюции микроорганизмов. Факторы, вызывающие мутации, называются мутагенами. Различают физические, химические и биологические мутагены.

К физическим мутагенам  относятся такие факторы, как температура, радиация, ультрафиолетовые лучи, ионизирующие излучения и др.

К химическим мутагенам  принадлежат многочисленные химические соединения и вещества, которые могут  изменять структуру генов, взаимодействуя с ДНК бактериальной клетки.

Биологическими  мутагенами являются бактериофаги и  продукты жизнедеятельности клеток, которые накапливаются в питательной  среде в результате размножения  и роста бактерий.

По широте изменений  генома бактерий мутации делят на генные - изменения регистрируют в пределах одного гена, хромосомные - в группе генов, точковые - в одном триплете.

В зависимости  от взаимодействия мутагенов на нуклеотид  бактериальной клетки или ее плазмиды, мутации делят на нуклеоидные  и плазмидные.

По направлению  выделяют прямые и обратные мутации. Прямые - это изменения генов бактерий, выделенных из естественной среды обитания. Обратные мутации - это возврат от измененного типа бактерий к естественному типу.

По фенотипическому  проявлению различают нейтральные, условно-летальные и летальные мутации.

Нейтральные мутации  фенотипически не проявляются. Условно-летальные  мутации ведут к изменению, но не к исчезновению функциональной активности фермента. Летальные - это мутации, ведущие  к полной потери способности клетки синтезировать жизненно необходимые ферменты, что приводит к ее гибели.